[發明專利]檢測人結核分支桿菌的電容式生物芯片的制備使用方法

有效

• 申請號: 201811235807.8
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN109321668B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 梁鑫;芮雙印;符修樂
• 申請（專利權）人: 梁鑫
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/6806;C12R1/32
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 王偉

1.一種檢測人結核分支桿菌的電容式生物芯片的制備方法，其特征在于，從NCBI下載結核分枝桿菌、牛結核分枝桿菌和非洲結核分枝桿菌的全基因序列，比較三者基因差異，選擇能特異性識別MTBC的IS6110基因作為靶基因一，選擇能區別牛型和人型結核分枝桿菌的ORF RD 11基因作為靶基因二；接著從中選出六段堿基片段分別作為DNA探針1、2、3、4、5、6，再對各DNA探針的3’端進行巰基修飾；最后，將經巰基修飾后的各DNA探針基因以共價鍵結合的方式固化到可變電容式微納米生物檢測芯片的極板一上，即得目標所需的檢測人結核分支桿菌的電容式生物芯片；其中，未經巰基修飾的各DNA探針的核苷酸序列具體如下：

DNA探針1：序列如SEQ ID NO.1所示；

DNA探針2：序列如SEQ ID NO.2所示；

DNA探針3：序列如SEQ ID NO.3所示；

DNA探針4：序列如SEQ ID NO.4所示；

DNA探針5：序列如SEQ ID NO.5所示；

DNA探針6：序列如SEQ ID NO.6所示；

所述可變電容式微納米生物檢測芯片的結構具體包括極板一、極板二；所述極板一上設有若干個檢測孔，檢測孔底部通過一層厚度為10nm～100μm的彈性絕緣薄膜封底，被封底的檢測孔內自底部覆有一層厚度為10nm～5000nm的導體或半導體鍍膜，所述檢測孔底部的導體或半導體鍍膜與彈性絕緣薄膜結合為一體式柔性可變形薄膜；所述極板二的上表面覆有一層與極板一檢測孔面積相匹配的導體或半導體鍍膜；上述各DNA探針基因以共價鍵結合方式固化的極板一位置即是極板一上，位于所述檢測孔底部的導體或半導體鍍膜上表面；

所述檢測人結核分支桿菌的電容式生物芯片的制備方法包括如下具體步驟：

(1)M.TB檢測基因的獲得：

從NCBI下載結核分枝桿菌、牛結核分枝桿菌和非洲結核分枝桿菌的全基因序列，比較三者基因差異，選擇能特異性識別MTBC的IS6110基因作為靶基因一，并選擇能區別牛型和人型結核分枝桿菌的ORF RD 11基因作為靶基因二；

靶基因一：以不易形成發夾結構，兩兩之間連續配對率低，及特異性好作為標準，選擇三段堿基片段作為“DNA探針”，并在3’端修飾巰基；修飾前的“DNA探針”核苷酸序列如下：

DNA探針1：序列如SEQ ID NO.1所示；

DNA探針2：序列如SEQ ID NO.2所示；

DNA探針3：序列如SEQ ID NO.3所示；

靶基因二：以不易形成發夾結構，兩兩之間連續配對率低，及特異性好作為標準，選擇三段堿基片段作為“DNA探針”，并在3’端修飾巰基；修飾前的“DNA探針”核苷酸序列如下：

DNA探針4：序列如SEQ ID NO.4所示；

DNA探針5：序列如SEQ ID NO.5所示；

DNA探針6：序列如SEQ ID NO.6所示；

(2)DNA探針的合成：

對步驟(2)得到的各DNA探針序列進行合成；

(3)M.TB檢測基因的固化：

a.將合成的各DNA探針使用ddH₂O進行稀釋，制成DNA混合溶液；

b.芯片使用前，通過無水乙醇進行清洗晾干，去除表面污漬；

c.使用磷酸緩沖液，與DNA混合溶液1:1混合后，加滿可變電容式微納米生物檢測芯片極板一上的檢測孔，再置于2～8℃環境中過夜；

d.使用ddH₂O清洗若干次，即得固化了M.TB探針的芯片，即目標所需的檢測人結核分支桿菌的電容式生物芯片。

2.根據權利要求1所述的檢測人結核分支桿菌的電容式生物芯片的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，將各DNA探針序列送往基因公司進行合成。

3.根據權利要求1所述的檢測人結核分支桿菌的電容式生物芯片的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，將合成的各DNA探針使用ddH₂O稀釋到10nmol/mL。

4.根據權利要求1所述的檢測人結核分支桿菌的電容式生物芯片的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，磷酸緩沖液的pH具體為4.5～5.0。

5.根據權利要求1所述的檢測人結核分支桿菌的電容式生物芯片的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，使用ddH₂O清洗3～7次，每次0.5～1.5min。