[發明專利]一種基于干細胞分泌素的生物敷料的制作方法

在審

• 申請號: 201811233729.8
• 申請日: 2018-10-23
• 公開（公告）號: CN109289077A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 李剛;王彬;林思恩;李郁偉
• 申請（專利權）人: 姬松茸科研基金有限公司
• 主分類號: A61L15/40
• 分類號: A61L15/40;A61L15/26;A61L15/18;A61L15/32;A61L15/44
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;吳偉文

1.一種基于干細胞分泌素的生物敷料的制作方法，其特征在于：所述制作方法包括以下幾個步驟：

步驟1：將人的成纖維細胞使用完全培養基接種至培養瓶中，并使成纖維細胞密度達到90％，得到原代成纖維細胞；

步驟2：將得到的原代成纖維細胞接種至覆有三維膠原凝膠培養皿中培養，獲得真皮層；

步驟3：將所獲得的細胞層置于聚己內酯高分子膜上，進行冷凍和干燥，獲得失活的真皮細胞層與聚己內酯高分子膜的復合層；

步驟4：將所獲得的失活的真皮細胞層、聚己內酯高分子膜復合層表面涂覆一層干細胞分泌素和一層水凝膠溶液后靜置，等待凝固后獲得生物敷料。

2.根據權利要求1所述的一種基于干細胞分泌素的生物敷料的制作方法，其特征在于：所述步驟1中：完全培養基包括DMEM培養基、F12培養基和胎牛血清，所述DMEM培養基、F12培養基和胎牛血清的體積比為8:4:3。

3.根據權利要求1所述的一種基于干細胞分泌素的生物敷料的制作方法，其特征在于：所述步驟2中：培養皿中添加了10％FCS MEM的細胞培養液,培養的具體方法：將培養皿放置于37℃添加了5％濃度的二氧化碳的培養箱中培養10天，每24h更換培養液一次。

4.根據權利要求1所述的一種基于干細胞分泌素的生物敷料的制作方法，其特征在于：所述步驟3中的冷凍和干燥具體方法包括：首先，將置于聚己內酯高分子膜上的真皮層放置于冷卻設備中冷卻至2℃左右，保溫1～2h，在冷卻過程中真皮層將與聚己內酯高分子膜逐漸貼合，然后，將真皮層置于在溫度為-40℃(13.33Pa)的凍干箱內凍結3～5h，將真皮層內的水分將凍結成冰，之后，關閉凍干箱，迅速通入制冷劑(氟里昂、氨)，使真皮層冷凍，并保溫2h或更長時間，以克服溶液的過冷現象，使真皮層完全凍結，再后，在真空1.3～13pa的環境下，在1h內將溫度升至-10℃，保溫6小時，在30min內將溫度升至0℃，保溫6小時，在1min內將溫度升至10℃，保溫2小時，將真皮層內的冰升華除去大部分水分，最后，將溫度在1min內升至25℃，保溫3小時，能夠除去真皮層中細胞內的結合水。

5.根據權利要求1所述的一種基于干細胞分泌素的生物敷料的制作方法，其特征在于：所述步驟4中干細胞分泌素為脂肪間充質干細胞、牙髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞或牙齦間充質干細胞內提取的干細胞分泌素。