[發明專利]一種高效的小鼠骨髓來源巨噬細胞的轉染方法及其應用

有效

• 申請號: 201811233196.3
• 申請日: 2018-10-17
• 公開（公告）號: CN111057719B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 沈萍萍;章文龍;唐嘉藎;黃亞紅
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明為一種高效的小鼠骨髓來源巨噬細胞的轉染方法及其應用，其包括以下步驟：1)首先將293T細胞傳代至60mm*15mm皿中，培養過夜，使其密度達到80％，按照目的質粒/psPAX2/pMD2.G的順序以6/3/1的比例進行慢病毒的包裝，以獲得高滴度慢病毒，滴度為2～3×10⁷TU/mL(總體積5mL)；2)取小鼠骨髓，加入鼠源M?CSF(10ng/mL)進行巨噬細胞誘導，在誘導的第二天加入慢病毒，可以獲得高轉染效率。本發明在巨噬細胞誘導過程中加入慢病毒，不但能夠提高了慢病毒的轉染效率，同時還能在不影響巨噬細胞得率的情況下，縮短實驗時間。

技術領域：

本發明涉及生物技術領域，具體為一種高效的小鼠骨髓來源巨噬細胞的轉染方法及其應用。

背景技術：

轉染是分子生物學和細胞生物學領域的重要實驗技術，是將外來遺傳物質轉移到真核細胞中的專門技術。隨著基因和蛋白質功能研究的深入，轉染已成為現代分子生物學研究中常見的基本方法，將外源遺傳物質引入細胞為細胞水平的基因功能研究奠定了基礎。隨著近年來基因工程技術的不斷發展，出現了多種多樣的轉染技術，按外源遺傳物質是否與基因組整合來分，轉染技術為穩定轉染和瞬時轉染兩大類；按轉染實施手段來分，轉染技術分為物理介導、化學介導和生物介導三大類。

物理介導的方法中比較常用的是電穿孔法，但細胞敏感性較高，且對細胞活力影響較大。目前實驗室最常用的是化學介導方法，以脂質體轉染法最為普遍，商品化脂質體轉染試劑易于使用和購買，對于293T等容易轉染的細胞，轉染效率較高且毒性較低，但對于原代細胞及其他難轉細胞，脂質體技術的轉染效率較低，無法滿足實驗要求，限制了該方法的使用。生物介導的方法常用的是慢病毒轉染技術和腺病毒轉染技術，適用于較難轉細胞如原代細胞，但制備過程較為復雜，且影響轉染效率因素較多。針對不同模型，使用不同的轉染方法，轉染技術的不同影響著轉染效率，從而影響到整個實驗結果。因此在進行細胞轉染前，需對轉染方法及需轉染的細胞等因素進行綜合分析，篩選出轉染的最適方法和條件，已達到最高轉染效率，滿足實驗要求。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎發展起來的病毒載體，包含了病毒包裝、基因轉染、穩定整合基因組所需要的遺傳信息，是慢病毒系統的主要組成部分。慢病毒載體可以感染處于有絲分裂活躍期的細胞，也可以感染分裂緩慢及處于分裂終末期的細胞，包括神經干細胞、造血干細胞、肝實質細胞和處于分化終末的神經元等。在體外培養細胞實驗和體內基因治療實驗中，由慢病毒載體攜帶需轉入的目的基因以得到可以長期而穩定的表達。此外，經過改建后的慢病毒載體不表達任何HIV-1蛋白，免疫原性低，可以容納約10kb左右的外源基因，因此大多數基因的cDNA都能被克隆入慢病毒載體。這些優點使慢病毒載體成為體內和體外基因轉染的一種有效工具。

巨噬細胞是單核-吞噬細胞系統中的重要成員，分布在身體的各個器官、組織中。巨噬細胞具有廣泛的功能，包括吞噬、抗原遞呈、防御微生物的細胞毒性作用，以及分泌生長因子、細胞因子、補體成分、溶菌酶、蛋白酶、凝血因子和前列腺素等，對機體的免疫功能、炎癥反應、組織重塑和疾病產生等具有重要作用。巨噬細胞可以被多種刺激信號激活，如病原體相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)，以及組織微環境中的細胞因子等，在天然免疫和獲得性免疫中都發揮著重要作用。巨噬細胞還調控著炎癥的起始和消退，在抗感染方面起到了“哨兵”的角色。同時巨噬細胞也可以促進機體正常發育，維持體內平衡狀態，在特定的病理條件下也對疾病的形成起到關鍵作用，如自身免疫病、自身炎癥性疾病、代謝性疾病以及腫瘤等。

體外將骨髓細胞誘導成巨噬細胞是研究巨噬細胞表型及功能的一個重要方法。骨髓來源的巨噬細胞相比于細胞株更貼合正常生理狀態，同時相比腹腔巨噬細胞更偏向于靜息狀態，因此該細胞更加適用于巨噬細胞相關實驗模型的構建。由于脂質體轉染巨噬細胞，容易使其極化，從而影響后續實驗結果，因此對于巨噬細胞轉染時更多會采用慢病毒轉染方式。骨髓來源巨噬細胞不具有增殖能力，為了保證后續實驗結果準確，因此需要較高的轉染效率。

發明內容：