[發(fā)明專利]TCF7L2基因單核苷酸多態(tài)性的熒光原位雜交測序方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811232007.0
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109182508A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王鶴堯;孫美娜
• 申請（專利權(quán)）人: 北京華夏時(shí)代生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6841;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京市眾天律師事務(wù)所 11478
• 代理人: 李新軍

1.TCF7L2基因單核苷酸多態(tài)性的熒光原位雜交測序方法，包括如下步驟：

(1)提取待測樣本的DNA；

(2)以步驟(1)獲取的DNA為模板，在dNTP、反應(yīng)緩沖液、DNA切割劑存在的情況下，在寡核苷酸分子的引導(dǎo)下進(jìn)行單鏈化衍生，所述寡核苷酸分子分為第一引導(dǎo)序列和第二引導(dǎo)序列，同時(shí)加入兩條序列各異的測序探針，分別被定義為第一測序探針和第二測序探針，在所述兩條探針的5’端分別被標(biāo)記了彼此不同的熒光分子，在其3’端分別被標(biāo)記了淬滅基團(tuán)，所述第一引導(dǎo)序列、第二引導(dǎo)序列、第一測序探針和第二測序探針為下列組合：

SEQ ID NO：1、2、3和4；

(3)對步驟(2)的單鏈化衍生物分別與第一測序探針和第二測序探針的雜交結(jié)果進(jìn)行判讀。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一測序探針標(biāo)記的熒光分子為5-羧基熒光素,第二測序探針標(biāo)記的熒光分子為六氯熒光素，所述淬滅基團(tuán)為BHQ。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的待測樣本為血液、體液、分泌物、代謝物、脫落物或組織樣本。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述待測樣本DNA模板濃度在10³個(gè)/uL以上。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)反應(yīng)體系中第一引導(dǎo)序列與第二引導(dǎo)序列的比例為1:2-1:6，第二引導(dǎo)序列：第一測序探針：第二測序探針比例為1：1：1。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)反應(yīng)體系中第一引導(dǎo)序列與第二引導(dǎo)序列的比例為1:4。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)反應(yīng)體系中的dNTP為5mM，緩沖液為10×，所述切割劑為2.5U/μl的核酸外切酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述衍生及雜交的循環(huán)步驟為：

(1)預(yù)變性95℃，10分鐘，1個(gè)循環(huán)；

(2)變性95℃，30秒，60℃～64℃退火進(jìn)行雜交，75秒，共進(jìn)行50-60個(gè)雜交循環(huán)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述判讀的方法為讀取兩種測序探針與單鏈化衍生物雜交測序后的熒光強(qiáng)度的St值之差。

10.一組用于檢測TCF7L2基因單核苷酸多態(tài)性的核苷酸分子組合，所述組合包括單鏈化衍生中所用的定義為第一引導(dǎo)序列和第二引導(dǎo)序列的寡核苷酸分子、以及定義為第一測序探針和第二測序探針的雜交測序探針，所述第一引導(dǎo)序列、第二引導(dǎo)序列、第一測序探針和第二測序探針為下列組合：

SEQ ID NO：1、2、3和4。