[發明專利]一種促進木薯渣基質發酵進程的真菌分離方法

在審

• 申請號: 201811230079.1
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109355196A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 束勝;王戰;郭世榮;孫錦;王玉
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.一種促進木薯渣基質發酵進程的真菌分離方法，其特征在于包括建立新鮮木薯渣發酵堆體，自然發酵；根據自然發酵進程的關鍵階段于初始期、升溫期、高溫期以及腐熟期四個時期分期取樣；對取樣菌種進行分離純化，純化培養的真菌接種到纖維素剛果紅培養基進行培養，并根據剛果紅培養基透明圈的有無初篩出具有纖維素分解能力的菌株；將初篩出的菌株接種到木薯渣固體培養基中發酵復篩，并依據固體發酵木薯渣的失重率和纖維素含量篩選出促進木薯渣基質發酵效果好的真菌。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于新鮮木薯渣發酵堆體的長度要大于2m，寬度要大于1m，高度要大于1m，并且要每兩天翻堆體一次。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于根據木薯渣發酵進程，分為四個關鍵階段不同溫度分批取樣，初始期在堆體溫度是25-27℃時取樣，升溫期在堆體溫度達到35-45℃時取樣，高溫期在堆體溫度達到55-60℃取樣，腐熟期在堆體溫度達到25-27℃時取樣；優選初始期在堆體溫度達到27℃時取樣，升溫期在堆體溫度達到35℃和45℃時取樣，高溫期在堆體溫度達到55℃和60℃取樣，腐熟期在堆體溫度達到27℃時取樣。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的對取樣菌種進行分離純化包括：分別將樣品制備成一定濃度梯度的懸浮液，然后采用馬丁氏培養基進行初步分離；再將馬丁氏培養基中生長的真菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行純化傳代培養。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述的懸浮菌液的制備方法為：稱取新鮮的樣品10g，放入盛90mL無菌水的錐形瓶中、200轉震蕩40min、過濾、濾液梯度稀釋制成10^-1-10^-4濃度梯度的菌懸液。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述初步分離采用在馬丁氏固體培養基上涂布的方法，培養的時間為3-5d，培養溫度與每個樣品的取樣溫度一致；所述純化傳代培養采用挑菌劃線的方法，并且要連續純化培養2-3次。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述纖維素剛果紅培養基培養的溫度與取樣時的溫度一致，培養時間為3-5d。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，木薯渣固體培養基的發酵在錐形瓶中進行，28℃下發酵10d，并且每隔三天搖瓶一次。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法還包括在復篩前或復篩后對菌株進行菌種鑒定的步驟。

10.根據權利要求1～9中任一項所述的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)建立新鮮木薯渣發酵堆體，自然發酵；堆體的長度要大于2m，寬度要大于1m，高度要大于1m，并且要每兩天翻堆體一次；

(2)根據自然發酵進程的關鍵階段分期取樣，分別為初始期、升溫期、高溫期以及腐熟期四個時期；取樣時的溫度分別為：初始期27℃；升溫期35℃和45℃；高溫期55℃和60℃；腐熟期27℃；

(3)對步驟(2)分階段取的樣品，分別將樣品制備成10^-1～10^-4濃度梯度的懸浮液，然后涂布到馬丁氏培養基上培養，培養的時間為3-5d，培養溫度與取樣階段的溫度一致；

(4)對步驟(3)中馬丁氏培養基生長的真菌，采用挑菌劃線的方法接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行純化傳代培養2-3次；

(5)對步驟(4)純化培養的真菌，接種到纖維素剛果紅培養基進行培養，培養的溫度與取樣時的溫度一致，培養時間為3～5d，并根據剛果紅培養基透明圈的有無篩選出具有纖維素分解能力的菌株。

(6)對步驟(5)篩選出的菌株進行內轉錄間隔區ITS測序比對；

(7)對步驟(6)鑒定出的真菌菌株進行發酵效果驗證比較，把步驟(6)的真菌接種到木薯渣固體培養基中28℃下發酵10d，并且每隔三天搖瓶一次，并依據固體發酵木薯渣的失重率和纖維素含量篩選出促進木薯渣基質發酵效果較好的真菌。