[發(fā)明專利]絲氨酸消旋酶突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811229177.3
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109251923B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 閆博;田方;焦華陽
• 申請（專利權(quán)）人: 天津博瑞威生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 琪琛

本發(fā)明公開了一種絲氨酸消旋酶突變體，突變后絲氨酸消旋酶氨基酸序列，其在水稻第162位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸，截斷其碳端氨基酸，并優(yōu)化其核苷酸序列使其可以在大腸桿菌里表達。本發(fā)明改造了絲氨酸消旋酶基因序列，對其進行定點突變和隨機突變，提高消旋活性的同時降低脫水活性，在提高DL?絲氨酸制備效率的同時降低對產(chǎn)物的水解，提高產(chǎn)率。而后優(yōu)化其密碼子，便于其在大腸桿菌中表達。使其適用于工業(yè)生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種絲氨酸消旋酶突變體。

背景技術(shù)

絲氨酸是天然存在的20種氨基酸之一，一般指L-絲氨酸。DL-絲氨酸包含兩個等量的光學(xué)異構(gòu)體，是脫羧酶抑制藥鹽酸芐絲肼的關(guān)鍵中間體，也是合成很多化合物的原料。目前制備方法主要有蛋白質(zhì)水解提取法、化學(xué)合成法以及生物酶催化法。絲氨酸雖然在某些蛋白質(zhì)如絲膠蛋白中含量豐富，但以蠶繭衣水解制取絲氨酸不但原料成本高昂，而且后續(xù)分離純化也困難，導(dǎo)致總成本較高。化學(xué)合成法制備DL-絲氨酸，涉及反應(yīng)步驟多，工藝復(fù)雜，反應(yīng)總收率偏低；原料或中間產(chǎn)物具有毒性，不易分離，導(dǎo)致產(chǎn)品分離純化困難，對環(huán)境不友好；化學(xué)合成法制備DL-絲氨酸總成本目前還是偏高。酶法催化制備絲氨酸一般是得到單一構(gòu)型的絲氨酸，再通過絲氨酸消旋酶將L或D絲氨酸轉(zhuǎn)化成DL-絲氨酸。本方法成本較低、污染小、毒性低，但野生絲氨酸消旋酶是一個雙功能酶，兼具消旋和脫水活性，可將L-\D-絲氨酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-\L-絲氨酸，還可以將L-\D-絲氨酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸。野生消旋酶消旋效率較低，而且由于脫水活性的存在會消耗大量的目標產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供一種絲氨酸消旋酶突變體，解決現(xiàn)有技術(shù)中野生消旋酶消旋效率較低，脫水活性消耗大量的目標產(chǎn)物的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種絲氨酸消旋酶突變體，所述絲氨酸消旋酶突變體氨基酸序列為SEQ ID NO.1。

所述絲氨酸消旋酶突變體是絲氨酸消旋酶第162位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸，截斷其碳端氨基酸。

本發(fā)明還提供了一種編碼絲氨酸消旋酶突變體的基因。

所述基因核苷酸序列為SEQ ID NO.3。

本發(fā)明還提供了一種重組表達載體，所述重組表達載體攜帶有編碼絲氨酸消旋酶突變體的基因。

本發(fā)明還提供了一種重組菌，所述重組菌為轉(zhuǎn)化有攜帶有編碼絲氨酸消旋酶突變體的基因的重組表達載體的宿主菌。

所述宿主菌為大腸桿菌。

與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明改造了絲氨酸消旋酶基因序列，對其進行定點突變和隨機突變，提高消旋活性的同時降低脫水活性，在提高DL-絲氨酸制備效率的同時降低對產(chǎn)物的水解，提高產(chǎn)率。而后優(yōu)化其密碼子，便于其在大腸桿菌中表達。使其適用于工業(yè)生產(chǎn)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

絲氨酸消旋酶基因的克隆。

1、首先參照基因數(shù)據(jù)庫序列合成絲氨酸消旋酶基因并設(shè)計引物：

基因序列參照NCBI Reference Sequence:XM_015781742.2在上海生工生物合成，序列來源于Oryza sativa Japonica Group(SEQ ID NO.2)。

2、用易錯PCR方法擴增絲氨酸消旋酶基因。

上游引物為F1：帶有BamhI內(nèi)切酶識別位點