[發明專利]一種基于納米金比色的microRNA-7a快速檢測方法

有效

• 申請號: 201811225475.5
• 申請日: 2018-10-20
• 公開（公告）號: CN109342338B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 朱文遠;梁曉琳;周琳瑩;李丹;溫其霖;潘宏程
• 申請（專利權）人: 桂林理工大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78;C12Q1/6825
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于納米金比色的microRNA-7a快速檢測方法，其特征在于具體步驟為：

（1）金納米粒子的制備：移取100 mL質量百分比濃度為0.01%的氯金酸溶液倒入圓底燒瓶中，將其放置油浴鍋中加熱煮沸后迅速加入1.5mL 質量百分比濃度為1%的檸檬酸鈉溶液作為還原劑，繼續加熱15分鐘，觀察溶液的顏色從最初的淡黃色逐漸變成酒紅色，最后停止加熱冷卻至室溫，并且全程處于攪拌狀態下進行,得到粒徑為24nm的納米金粒子；

（2）設計與目標物miRNA-7a互補的堿基數22~40mer探針Probe；

（3）將終濃度為5.33 ~259.74 nmol/L的目標物miRNA-7a與物質的量為40~200pmol，堿基數為22~40mer探針Probe混合后，置于33~43℃下雜交30分鐘，得雜交混合溶液；

（4）將步驟（3）所得雜交混合溶液置于200μL步驟（1）所得的金納米粒子溶液中震蕩混勻,在室溫下靜置10分鐘；

（5）往步驟（4）所得混合液中加入100μL濃度為10 mmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖溶液，其中含濃度為60~200 mmol/L 的NaCl，平衡2分鐘后，使用數碼相機拍照做顏色對比；

（6）使用紫外可見光譜儀對步驟（5）所得溶液進行檢測，分別在524nm和700nm出現特征峰；記錄濃度分別為5.33~259.74 nmol/L目標物miRNA-7a的紫外光譜；

（7）檢驗方法的特異性：探針probe的堿基數為34mer，NaCl的濃度為大于或者等于160mmol/L，探針probe物質的量為80pmol，雜交溫度為30℃；分別取與目標物miRNA-7a同種類的序列濃度為131.57 nmol/L的miRNA-7d、miRNA-7e、miRNA-7g以及不加入miRNA-7a按照步驟（2）~（6）進行實驗操作，記錄濃度為0 nmol/L miRNA-7a、131.57 nmol/L的miRNA-7a、miRNA-7d、miRNA-7e、miRNA-7g的紫外光譜；

所述的34mer探針probe的堿基序列為：5′-TTTTTTAACTATACAACCTACTACCTCATTTTTT-3′，miRNA-7a的堿基序列為：5′-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3′，miRNA-7d的堿基序列為：5′-AGAGGTAGTAGGTTGCATAGT-3′，miRNA-7e的堿基序列為：5′-TGAGGTAGGAGGTTGTATAGT-3′，miRNA-7g的堿基序列為5′-TGCGGTAGTAGTTTGTACAGTA-3′。