[發(fā)明專利]一種獲得高保真且3’末端加“A”產(chǎn)物的PCR法

有效

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• 申請日: 2018-10-19
• 公開（公告）號: CN109321643B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫達(dá)權(quán);石靜;周莉莉;張欣;胡桐;張欽真
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 貴陽中新專利商標(biāo)事務(wù)所 52100
• 代理人: 胡緒東

本發(fā)明公開了一種獲得高保真且3’末端加“A”產(chǎn)物的PCR法，該方法為：首先在PCR反應(yīng)體系中加入各反應(yīng)組分與高保真Taq DNA polymerase，然后按如下反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：(1)95℃預(yù)變性2min；(2)95℃，15sec；退火溫度，30sec；72℃，延伸時(shí)間；28循環(huán)；(3)在反應(yīng)的PCR管中直接加入普通Taq DNA聚合酶并混勻；(4)95℃，15sec；退火溫度，30sec；72℃，延伸時(shí)間；3循環(huán)；(5)72℃，10min。本發(fā)明在利用高保真Taq DNA polymerase進(jìn)行PCR反應(yīng)的最后3個(gè)循環(huán)中加入普通Taq DNA polymerase，PCR完成后即可獲得具有高保真性的3'末端加“A”的PCR產(chǎn)物，克服了當(dāng)前高保真PCR過程中無法在產(chǎn)物3'末端直接加“A”的問題，省略了以前需要對高保真PCR產(chǎn)物純化后再用加“A”的過程，簡化了高保真PCR產(chǎn)物TA克隆前的處理步驟。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種獲得高保真且3’末端加“A”產(chǎn)物的PCR法，屬于PCR法技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

PCR技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域最經(jīng)典也是最常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，主要用于基因檢測和克隆，由于其過程簡單、實(shí)驗(yàn)周期短、重復(fù)性好、且試劑成本相對較低，使其成為分子生物學(xué)領(lǐng)域中最受歡迎的方法之一。在基因獲取上，雖然目前有許多方法可供選擇，如化學(xué)合成，但PCR技術(shù)具有不可替代的優(yōu)勢，且仍是最重要的方法。

PCR技術(shù)用于基因克隆的基本過程是首先獲取靶基因的DNA模板或cDNA模板，然后設(shè)計(jì)并合成靶基因的上游引物和下游引物，選用適當(dāng)?shù)腡aq DNA polymerase和PCR程序經(jīng)高效擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物，即靶基因DNA，產(chǎn)物經(jīng)純化和適當(dāng)處理后克隆入克隆載體，并經(jīng)過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定獲得靶基因。

PCR產(chǎn)物導(dǎo)入克隆載體中因產(chǎn)物的不同而有所差異，這與PCR過程中選擇的TaqDNA polymerase密切相關(guān)。如果選用普通的Taq DNA polymerase，其PCR產(chǎn)物的3'末端有一個(gè)自帶的突出的“A”，它可以與市面上的TA克隆載體直接通過T-A配對連接而高效獲得帶有靶基因的克隆載體。但是，由于普通Taq DNA polymerase自身特性，其PCR產(chǎn)物常伴有一定的堿基突變，不能真實(shí)克隆靶基因，為克服這一缺陷，目前分子生物學(xué)上常用具有保真性的Taq DNA polymerase替代常規(guī)的Taq DNA polymerase，如pfu DNA polymerase、platinumTaq DNA polymerase、High-Fidelity DNA polymerase等，但無論是哪一種高保真Taq DNApolymerase，其PCR產(chǎn)物末端為平末端，不存在3'突出“A”，為保證該P(yáng)CR產(chǎn)物能夠克隆入克隆載體中，目前生物試劑公司推出了平末端克隆載體，但克隆效率低這一缺陷限制了這種平末端載體的推廣和運(yùn)用。考慮到這一問題，生物試劑公司還推出對PCR平末端產(chǎn)物加“A”的A-tailing酶，通過對純化的PCR平末端產(chǎn)物的3'末端加“A”，實(shí)現(xiàn)T-A克隆，這一方法效率較高，受到廣大科研工作者的歡迎，但其過程需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定、純化、加“A”等步驟才能進(jìn)行TA克隆。

綜上所述，用普通Taq DNA polymerase擴(kuò)增的目的DNA片段雖然3'末端有突出的“A”，但其內(nèi)部常含有突變位點(diǎn)；用高保真Taq DNA polymerase擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物其3'末端為平末端，不能直接進(jìn)行TA克隆，需要對PCR產(chǎn)物用特殊的加“A”試劑盒在3'末端加“A”后才能進(jìn)行TA克隆；而將普通Taq DNA聚合酶和高保真Taq DNA聚合酶直接混合使用(如某生物公司的Taq Platinum DNA Polymerase)雖然部分解決了上述問題，但PCR產(chǎn)物的高保真性和產(chǎn)物3'末端加“A”效率均明顯下降。

因此，探索一種可以獲得高保真PCR產(chǎn)物且3'末端加“A”的簡單、快速的方法具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容