[發(fā)明專利]細胞凋亡檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2018-10-19
• 公開（公告）號: CN111073947A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹春雨;劉鈺妮;王世恩
• 申請（專利權(quán)）人: 三峽大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務(wù)所 42103
• 代理人: 成鋼

本發(fā)明公開了一種細胞凋亡檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用，該試劑盒，包括共價結(jié)合了熒光素FITC的Annexin V，還包括熒光染料DAPI。所述DAPI的濃度＜150nM。本發(fā)明還涉及采用所述的試劑盒檢測細胞凋亡的方法，以熒光素FITC共價結(jié)合的Annexin V特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸來識別凋亡細胞，聯(lián)合DAPI標記死細胞和凋亡晚期細胞；最后利用流式細胞儀或者熒光顯微鏡檢測細胞凋亡的發(fā)生并區(qū)分凋亡早、晚期的細胞和死細胞。使用Annexin V?FITC組合DAPI的雙染法能夠有效避免具有紅色到橙色熒光基團的藥物對細胞凋亡檢測的干擾。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是指一種基于AnnexinV-FITC和DAPI雙標記的細胞凋亡檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

細胞凋亡存在于多細胞生物的整個生命過程當中，可及時清除機體內(nèi)多余和受損傷的細胞，維持組織器官的穩(wěn)定性，在維持組織、器官的正常形態(tài)和功能方面起重要作用。目前采用的細胞凋亡檢測方法包括：利用光學顯微鏡的細胞形態(tài)學檢測法、DNA片段化分析法、原位末端缺口標記法(TUNEL)和Annexin V-FITC/PI雙染法等。其中Annexin V-FITC/PI雙染法由于靈敏度和特異性高，并且操作簡便易行，評價指標客觀而成為目前應(yīng)用最為廣泛的細胞凋亡檢測方法。

其實驗原理是：正常細胞中，磷酯酰絲氨酸(PS)位于細胞脂質(zhì)雙層膜的內(nèi)側(cè)；只有當細胞凋亡發(fā)生時，磷酯酰絲氨酸會翻轉(zhuǎn)到細胞膜外側(cè)。Annexin V能在Ca²⁺存在情況下特異性識別與結(jié)合細胞膜外側(cè)的磷酯酰絲氨酸，通過使用共價結(jié)合了熒光素FITC的AnnexinV即可標記凋亡細胞。此外，由于正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜相對完整而凋亡晚期及壞死細胞的細胞膜通透性顯著增加，使得核酸染料碘化丙啶(propidine iodide,PI)能夠選擇性進入凋亡中晚期及壞死細胞而標記。由此，通過熒光素FITC(Fluoresceinisothiocyante，異硫氰酸熒光素酯)共價結(jié)合的Annexin V特異性識別細胞膜外表面的PS，聯(lián)合PI檢測凋亡晚期和壞死細胞，即可使用流式細胞儀檢測細胞凋亡的發(fā)生，同時區(qū)分凋亡早、晚期的細胞及壞死細胞并確定其比例。

然而，在當前腫瘤細胞凋亡研究中，多種細胞凋亡誘導(dǎo)藥物如蒽環(huán)類藥物鹽酸多柔比星和光敏劑如玫瑰紅(Rose bengal)等，具有與PI相同的激發(fā)光(535nm)和發(fā)射光波長(617nm，橙色到紅色范圍)，從而導(dǎo)致上述藥物處理后的細胞在使用Annexin V-FITC/PI雙染法進行細胞凋亡檢測時無法區(qū)分壞死細胞與正常、凋亡細胞。

鑒于上述原因，目前仍需提供新的簡便易行、具有高靈敏度和特異性的方法用于細胞凋亡的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種細胞凋亡檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用，該試劑盒可以可檢測細胞凋亡的發(fā)生并區(qū)分凋亡早、晚期的細胞和死細胞，同時有效避免具有紅色到橙色熒光基團的藥物對細胞凋亡檢測的干擾。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種細胞凋亡檢測試劑盒，包括共價結(jié)合了熒光素FITC的Annexin V，還包括熒光染料DAPI。

進一步地，所述DAPI的濃度＜150nM。

本發(fā)明還涉及采用所述的試劑盒檢測細胞凋亡的方法，以熒光素FITC共價結(jié)合的Annexin V特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸來識別凋亡細胞，聯(lián)合DAPI標記死細胞和凋亡晚期細胞；最后利用流式細胞儀或者熒光顯微鏡檢測細胞凋亡的發(fā)生并區(qū)分凋亡早、晚期的細胞和死細胞。

本發(fā)明還涉及所述試劑盒在檢測細胞凋亡中的用途。

本發(fā)明還涉及所述試劑盒在檢測細胞凋亡中的用途，檢測過程中使用具有紅色到橙色熒光的藥物誘導(dǎo)細胞凋亡。