[發(fā)明專利]一種外切菊粉酶、其制備方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811220979.8
• 申請(qǐng)日: 2018-10-19
• 公開（公告）號(hào): CN109207456A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫媛霞;朱萍;朱玥明;曾艷;門燕;楊建剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12N15/56;C12N15/75;C12N1/21;C12P19/14;C12P19/02;A23L29/00;A23K10/14;C12R1/125
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本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種來源于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的外切菊粉酶及其基因。本發(fā)明還公開了一種分泌表達(dá)該外切菊粉酶的重組枯草芽孢桿菌菌株，該工程菌株是通過構(gòu)建外切菊粉酶重組表達(dá)載體，再將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌后獲得。利用該工程菌株發(fā)酵可實(shí)現(xiàn)外切菊粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)，分泌表達(dá)量超過1g/L。本發(fā)明公開的外切菊粉酶性質(zhì)如下：最適反應(yīng)溫度為40°C，最適pH 7.0，無明顯的金屬離子依賴性。該外切菊粉酶通過枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)后，最適溫度和穩(wěn)定性較純酶有顯著提升，可在短時(shí)間內(nèi)有效水解菊粉制備高果糖漿，應(yīng)用于食品、飼料及生物能源等領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種來源于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的外切菊粉酶及其基因。通過構(gòu)建該酶重組表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)其在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)，通過發(fā)酵法制備外切菊粉酶。該酶可在短時(shí)間內(nèi)有效水解菊粉制備高果糖漿，應(yīng)用于食品、飼料及生物能源等領(lǐng)域。

背景技術(shù)

菊粉（Inulin)，又稱菊糖，是果糖分子間以β-(2→1) 糖苷鍵相連，末端通過α-(1→2) 鍵與葡萄糖殘基連接組成的鏈狀多糖，聚合度通常為2~60。菊粉廣泛存在于各種植物的根和塊莖中，例如大麗花、菊苣和菊芋等，近年來作為一種可溶性膳食纖維，因其在改善腸道微環(huán)境、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、調(diào)節(jié)血糖等方面特有的生理功能受到廣泛關(guān)注，同時(shí)其中富含的多聚果糖也被作為重要的工業(yè)原料，如通過不同的微生物水解菊糖，制備純度較高的果糖糖漿以及生物燃料乙醇、丁醇等。

菊粉酶（Inulinase），學(xué)名β-2,1-D果聚糖酶（EC3.2.1），是一種主要來源于微生物的多糖水解酶，根據(jù)其對(duì)底物作用的方式，又分為外切菊粉酶（exo-inulinase）和內(nèi)切菊粉酶（endo-inulinase）。外切水解酶可從菊粉非還原末端催化水解-D-呋喃果糖殘基，生成果糖含量較高的高果糖漿。產(chǎn)生菊粉酶的微生物來源廣泛，主要包括真菌、細(xì)菌、酵母，其中以曲霉屬（Aspergillus）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）生產(chǎn)的菊粉酶研究最為廣泛，近年來，細(xì)菌來源的菊粉酶因在極端條件（高溫、高鹽、強(qiáng)酸）耐受性強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短等方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)而受到更多關(guān)注。

盡管具有廣泛的微生物來源，菊粉酶在目前的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中仍存在一系列問題：1）菊粉酶產(chǎn)量偏低。菊粉酶在微生物中的表達(dá)量較低，導(dǎo)致產(chǎn)酶成本過高，限制了工業(yè)上的應(yīng)用。2）菊粉酶的酶學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，作用條件普遍偏酸性（pH5.5-6.5），穩(wěn)定性較差，即使在最適反應(yīng)溫度下也很快失活。因此，挖掘性質(zhì)穩(wěn)定、可高效表達(dá)的外切菊粉酶是推動(dòng)菊粉酶走向應(yīng)用的關(guān)鍵。同時(shí)菊芋作為一種非糧作物，是生產(chǎn)果糖及高果糖漿的理想原料，挖掘優(yōu)質(zhì)外切菊粉酶、建立酶制劑高效制備方法是促進(jìn)菊芋資源高值化利用的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種新型的外切菊粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示。

本發(fā)明的目的之二是提供編碼該外切菊粉酶的核苷酸序列，如SEQ ID No: 2所示。

本發(fā)明的目的之三是提供含有上述外切菊粉酶核苷酸序列的重組表達(dá)載體。為了對(duì)該外切菊粉酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，構(gòu)建該酶的大腸桿菌表達(dá)載體pET21a-Inu；為實(shí)現(xiàn)該酶的分泌表達(dá)，構(gòu)建該酶的枯草芽孢表達(dá)載體pMA5-Inu；重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程見圖1A、圖1B。

本發(fā)明的目的之四是提供含有該外切菊粉酶基因的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞及其后代。將該酶的大腸桿菌表達(dá)載體pET21a-Inu轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），獲得胞內(nèi)表達(dá)該酶的大腸桿菌；將該酶的枯草芽孢表達(dá)載體pMA5-Inu轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，獲得高效分泌該酶的枯草芽孢桿菌工程菌株。