[發明專利]一種利用乳清生產乙醇的方法

有效

• 申請號: 201811220905.4
• 申請日: 2015-09-29
• 公開（公告）號: CN109161565B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 鄒靜;李軍;康維民;崔蕊靜;張建才
• 申請（專利權）人: 河北科技師范學院
• 主分類號: C12P7/06
• 分類號: C12P7/06;C12R1/865
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發明提供一種高效利用乳清生產乙醇的方法，所述方法是通過利用一株保藏編號為CGMCC No.11223的乳清利用型釀酒酵母工程菌在含有乳清或乳糖的培養基中靜置培養發酵來生產乙醇。本發明所述釀酒酵母菌，在緩解葡萄糖阻遏現象的同時消除釀酒酵母菌自身的半乳糖代謝調控，該菌能夠在乳清濃度為120g/L(乳糖含量為53.1g/L)的培養基中生長、發酵產乙醇，發酵周期為54h，乳清中乳糖利用率為98.7％，無水乙醇對乳糖得率為49.7％(相當于理論得率的92.3％)；同時緩解了葡萄糖對半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖同時被利用。

本申請是如下專利申請的分案申請，原申請的申請號：2015106320883，申請日：2015-09-29，發明名稱：一株高效利用乳清產乙醇的釀酒酵母工程菌及其構建方法。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，尤其是利用一株乳清利用型釀酒酵母工程菌高效利用乳清生產乙醇的方法。

背景技術

乳清是指在制造干酪或干酪素時，分離出絮凝物后剩下的極稀薄的液體，是工業生產干酪及干酪素的副產品，每生產1t的干酪產生9t乳清，含有牛奶中55％的營養，但是由于乳清具有很高的BOD和COD，所以對環境造成很大的負擔。目前，全球乳清產量約為16億噸，而只有其中的50％得到處理，用于食品、飼料等方面，剩下的約8億噸沒有得到有效利用，被排泄到自然界中，不但造成環境的污染，而且還造成該資源的巨大浪費。乳清中除了含有20％乳品蛋白外，含量最多的是乳糖，約占乳清5％左右，是產生高BOD和COD的主要原因。

如何利用乳清中的乳糖，從而減低乳清對環境的污染一直是乳制品行業關注的問題。乳糖的利用主要有以下幾個方向：用于食品行業、用于飼料行業、用于醫藥行業。但是隨著全球能源危機的加劇，以及世界糧食安全問題等因素，乳清成為新的生產燃料乙醇的主要原料，也使得利用乳清生產燃料乙醇成為一個全新的熱點。

目前國外利用乳清生產燃料乙醇已有40多年的歷史，所使用的菌種主要有克魯維酵母和釀酒酵母。克魯維酵母雖然能夠利用乳清，但是該屬酵母酒精產率低，抗逆性差，菌體生長量大，不適用于生產乙醇。釀酒酵母雖然是生產乙醇的最佳首選，但是野生型釀酒酵母不能夠利用乳清為唯一碳源，所以如何改造釀酒酵母，使其可以發酵乳清產乙醇，一直是科研人員的研究熱點。目前國外的解決方法主要分為以下幾種：一、是利用原生質體融合技術，對釀酒酵母及克魯維酵母進行融合，篩選既可以利用乳糖又能高效產乙醇的突變株；二、是采用基因工程手段，把外源基因導入到釀酒酵母體內，使得釀酒酵母具有分解乳糖的能力，從而解決其不能利用乳清的問題。目前導入最多的外源基因為克魯維酵母的LAC4基因(編碼乳清分解酶)和LAC12基因(編碼乳清通透酶)。但是上述兩種方法所構建的菌株均存在乳清利用緩慢、發酵周期長等問題。

對于Lac⁺釀酒酵母工程菌株而言，乳清中的乳糖先要被分解成葡萄糖和半乳糖之后才會再繼續代謝。而對于釀酒酵母來說，其在利用半乳糖和葡萄糖時存在巨大差異，這種差異既包括半乳糖代謝自身的調控，也包括葡萄糖對半乳糖利用酶系的抑制，即葡萄糖阻遏現象。半乳糖作為釀酒酵母的“替代碳源”，耗氧狀態下其代謝速率僅為葡萄糖代謝速率的1/3。半乳糖需先經過Leloir途徑代謝成6-磷酸葡萄糖后才能進入糖酵解途徑被酵母利用。Leloir途徑所需酶由GAL基因編碼，釀酒酵母的GAL基因屬于典型的表達調節基因。有四種基因產物參與了GAL基因系統的這種表達調節，它們分別是位于XVI染色體上的GAL4基因編碼一種能結合上述五種基因的上游序列位點并激活這些基因轉錄的Gal4蛋白；還有位于染色體XIII上的GAL80基因編碼的Gal80蛋白則能和Gal4蛋白直接結合，從而抑制Gal4的轉錄激活功能；以及位于染色體IV上的GAL3基因編碼的Gal3蛋白可以在半乳糖誘導信號的作用下同ATP、半乳糖發生別構效應，產生的別構效應物同Gal80蛋白結合，釋放Gal4蛋白，但是目前半乳糖產生誘導信號的作用機制還不清楚。除了上述三種調控蛋白外，最近研究表明位于染色體XIV上的GAL6基因編碼的Gal6蛋白也屬于GAL調控基因的一種，Gal6蛋白會影響GAL家族基因轉錄mRNA的穩定性。