[發明專利]一種來自短小芽孢桿菌的ω-轉氨酶及在生物胺化中的應用

有效

• 申請號: 201811219769.7
• 申請日: 2018-10-19
• 公開（公告）號: CN109402188B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 廖祥儒;翟李欣;賴英杰;楊邵嵐;蔡宇杰;管政兵
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12P13/04;C12N9/10;C12N15/54;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種來自短小芽孢桿菌的ω?轉氨酶及在生物胺化中的應用，屬于生物工程技術領域。本發明首次從Bacillus pumilus W3中分離、鑒定了ω?轉氨酶基因，并選用大腸桿菌重組表達系統生產密碼子優化后的ω?轉氨酶能大幅提高其產量，使更易達到工業化應用要求。本發明發現該ω?轉氨酶以(R)?α?phenethylamine為底物時，最適作用pH為7.0，最適作用溫度為45℃；同時，該R?ω?轉氨酶pH穩定性及溫度穩定性都非常好，對實驗組(以(R)?α?phenethylamine為底物)的催化活性優于對照組(以(S)?α?phenethylamine為底物)，表明該重組ω?轉氨酶具有很好選擇性合成R?手性胺的功能，具有較大應用潛力。

技術領域

本發明涉及一種來自短小芽孢桿菌的ω-轉氨酶及在生物胺化中的應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

轉氨酶(aminotransferase，transaminase)屬于轉移酶類，通常用于催化氨基由氨基供體化合物轉移至氨基受體化合物。普遍存在于動物，植物組織和眾多微生物中。其中，心肌、腦、肝、腎等動物組織以及綠豆芽中轉氨酶含量較高。人體內轉氨酶含量的提高往往導致肥胖癥及代謝綜合癥，最終導致脂肪肝的形成。轉氨酶在生物催化反應中參與氨基酸的分解和合成，它催化某一氨基酸的α-氨基轉移到另一α-酮酸的酮基上，生成相應的氨基酸，同時具有一定的選擇性，原來的氨基酸則轉變成α-酮酸。轉氨酶還參與許多代謝途徑，包括維生素合成，碳氮吸收，次級代謝等。例如天冬氨酸轉氨酶(AspAT)是轉氨酶家族中最先被提純出來進行科學研究的，它有被稱為谷草轉氨酶，用于研究V_B6在氮代謝過程中的作用。轉氨酶分為R和S兩種類型，因S型選擇性的轉氨酶遠豐富于R型選擇性，因此它們有更多的結構信息可供參考，研究也更廣泛。

轉氨酶是輔酶5-磷酸吡哆醛(PLP)依賴型，其催化反應是可逆的，在反應過程中PLP和5-磷酸吡哆胺(PMP)會相互進行轉換。轉氨酶的底物并不專一，因此可以用一種轉氨酶合成各式各樣的氨基酸。轉氨酶對作為氨基供體的不同氨基酸底物的催化活性相差巨大，不同底物的酶活可能相差數個數量級，其命名主要是根據其催化活力最大的氨基酸來決定，比如天冬氨酸轉氨酶即對天冬氨酸的催化活力最大，苯丙氨酸轉氨酶的氨基供體最適底物為苯丙氨酸。轉氨酶催化的不對稱反應是合成手性氨基酸的一種重要途徑。根據不同可變區的差異，將文獻報道的不同來源的轉氨酶的蛋白質序列進行比較和聚類分析，再根據親水位點的疊加和迭代對比，我們可以將轉氨酶分為4類。其中ω-轉氨酶屬于第二亞族，常用于制備手性胺及非天然氨基酸，如β-氨基酸。因為ω-轉氨酶的大口袋結合區域比天冬氨酸轉氨酶(AspATs)和芳香族轉氨酶(AroATs)稍大，所以它可能能夠結合比天然氨基酸體積較大的底物。與其他轉氨酶一樣，ω-轉氨酶能夠可逆的催化氨基由供體化合物轉移至受體化合物的反應。通常情況下，轉氨酶被定義為一類酶，在所催化氨基轉移反應中，在底物和產物中，至少有一個不是α-氨基酸或者α-酮酸。在“ω-轉氨酶”這個慣用名中，希臘字母“ω”與羰基的位置沒有關系，它僅僅代表不是α位。目前，已經有很多野生菌株被發現ω-轉氨酶的存在，例如弧菌(Vibrio fluvialis)，色桿菌(Chromobacterium violaceum)，球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)，節桿菌(Arthrobacter sp.)等。與S型ω-轉氨酶相比，R型ω-轉氨酶的起步較晚。隨著轉氨酶在合成手性胺的應用越來越多，資源相對缺乏的R型ω-轉氨酶受到了越來越多的關注。目前，對于R型ω-轉氨酶的研究主要有以下幾個方面：尋找R型ω-轉氨酶的資源；對現有R型ω-轉氨酶進行結構改造；ω-轉氨酶反應過程研究及條件優化；以及R型ω-轉氨酶底物特異性研究。