[發明專利]一種利用LC-MS/MS檢測食品中甲殼動物原肌球蛋白的方法

有效

• 申請號: 201811219583.1
• 申請日: 2018-10-19
• 公開（公告）號: CN109061013B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 王建華;葛敏敏
• 申請（專利權）人: 青島海關技術中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;邱岳

1.一種利用LC-MS/MS檢測甲殼動物原肌球蛋白的方法，包括如下步驟：

步驟（1）從UniProt蛋白庫搜索到甲殼動物原肌球蛋白氨基酸序列；該原肌球蛋白氨基酸序列長度為284，涵蓋了19種蝦、3種蝦蛄、2種蝦鰲、3種龍蝦和10種蟹在內的37種甲殼動物；

步驟（2）將該氨基酸序列導入DNAMAN 軟件，進行氨基酸序列對比，得到其高度保守區域80-215，同源性高達98.52％；

步驟（3）將原肌球蛋白高度保守區域導入Skyline 軟件，模擬酶解過程，模擬酶解結束后得到一系列肽段；

步驟（4）選擇不含有半胱氨酸C和蛋氨酸M、且長度在8-18個氨基酸之間的肽段，得到此類肽段⁹²IQLLEEDLER¹⁰¹、¹¹³LAEASQAADESER¹²⁵、¹⁵³FLAEEADR¹⁶⁰、¹⁹⁰IVELEEELR¹⁹⁸、²⁰⁶SLEVSEEK²¹³共五個；

步驟（5）將上述五個肽段進行高分辨質譜檢測，選擇響應高、重復性好的IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR三個肽段作為甲殼類動物原肌球蛋白的特征肽段；

步驟（6）將特征肽段進行化學合成，制備純度高于95%的標準品；

步驟（7）特征肽段的定量子離子峰面積作為縱坐標分別繪制標準曲線，得到三個方程；其中，液相色譜條件：色譜柱：EC-C18分析柱；流動相A:0.1%甲酸水；流動相B：0.1%甲酸乙腈；使用以下梯度：0 min，10%B；4 min，25%B；10 min，30%B；10.1 min，100%B；12 min，100%B；14 min，10%B；17 min，10%B；流速：0.3 mL·min^-1；柱溫：35 °C；進樣體積：10 mL；質譜條件為：離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測；氣體：氮氣；干燥氣溫度：300 °C，干燥氣體流量12.0 L/ min；霧化器氣體壓力：40 psi，電噴霧毛細管電壓：3500 V；

步驟（8）在上述三十七種甲殼類動物中選擇其中一種，將該動物的肌肉組織與含有1mol/LKCl的50 mmol/L Tri-HCL且PH = 7.4的蛋白提取緩沖液按照1：10比例混合勻漿，水平震蕩30 min，離心后取上清；100 ℃加熱5 min，離心取上清液，得到蛋白提取液，通過BCA方法測得其蛋白質濃度；

取蛋白提取液100 μL用純水稀釋10倍，按照胰蛋白酶與蛋白的質量比1：30，1：15，1：10，2：15，1：6，1：5和1：3添加胰蛋白酶進行酶用量的優化，酶解時間均為16 h，加入1%甲酸終止酶解，用固相萃取柱對酶解液進行凈化，待LC-MS/MS檢測，通過酶解結果可知，IVELEEELR在不同酶濃度條件下酶解性質穩定用作定量肽段， IQLLEEDLER、LAEASQAADESER酶解性質不穩定用作為定性肽段；因此最終選擇酶與蛋白的質量比為1：15作為最優的酶添加量；在酶與蛋白的質量比為1：15的基礎上對1 h、3h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h和16 h八個酶解時間進行優化，酶解時間達到13 h后三個特征肽段的酶解水平趨于穩定，因此選擇酶解時間為13 h；

（9）以步驟（8）所選甲殼類動物的肌肉制備肌原纖維蛋白丙酮粉末，并重新溶解在50mmol/L Tris-HCl緩沖液中；經過50％硫酸銨飽條件下的鹽析提取和2次pH4.5等電點沉淀后，從肌原纖維蛋白溶液中獲得原肌球蛋白沉淀；將沉淀溶于水溶液中，用透析袋進行透析除鹽，透析液為水，間隔6h換一次透析液，重復3次；將透析過的原肌球蛋白溶液冷凍干燥后，配置成1mg/mL水溶液，進行酶解，酶解方法與步驟（8）一致；

步驟（10）以定量肽段IVELEEELR的標準曲線作為樣品檢測的定量標準曲線；

步驟（11）提取待測樣品總蛋白，樣品總蛋白經過酶解后凈化，得到凈化酶解液，酶解采用步驟（8）得到的酶解優化條件，將得到的凈化酶解液進行LC-MS/MS檢測，得到食物樣品中定量肽段子離子峰面積，再根據標準曲線求得樣品中定量肽段濃度，進而得到樣品原肌球蛋白濃度。

2.如權利要求1所述的一種利用LC-MS/MS檢測甲殼動物原肌球蛋白的方法，其特征是所述定量肽段IVELEEELR的標準曲線為： y=1.1586x+425.3614；其中，y為定量肽段定量離子峰面積，x為定量肽段濃度，標準品濃度的范圍為1-1000 μg/L。