[發明專利]一種體外腸道模型的構建方法和應用

在審

• 申請號: 201811219212.3
• 申請日: 2018-10-19
• 公開（公告）號: CN109321529A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 胡夢欣;黃晶晶
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 杭州宇信知識產權代理事務所(普通合伙) 33231
• 代理人: 張宇娟

本發明公開了一種體外腸道模型的構建和應用，該模型主要基于靜電紡納米纖維膜的物理仿生結構，為Caco?2細胞提供一種理想的黏附和生長微環境，縮短細胞培養周期，快速形成完整的Caco?2單細胞層并促進Caco?2細胞的分化，發揮對營養物質和藥物分子等組分的吸收轉運代謝的生理功能，用于快捷、準確評估營養物質和藥物的吸收能力和生物利用度，也可用于評估腸道微生物定殖或相互作用。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種體外腸道模型的構建方法，還涉及利用構建的模型快捷、準確評估營養物質和藥物的吸收能力和生物利用度。

背景技術

體外腸道吸收模型被廣泛用于藥物和營養物質吸收的評估，其吸收性數據被用于早期藥物開發和營養物質開發的體外快速分析和篩選。近十余年來，國內外已普遍采用細胞模型作為藥物和營養物質等成分的腸道吸收模型。其中Caco-2腸道細胞模型來源于人的結腸癌細胞，是著名的小腸吸收模型，已被發達國家的藥物研究機構或開發公司廣泛采用，是目前最為經典的一種體外腸道模型。作為一種附著依賴型細胞，Caco-2細胞最常見的培養模型是單層貼壁培養模型。Caco-2細胞一般培養在具有滲透性的多孔高分子膜上，并制作成插入式濾膜(permeable insert)的形式，如商業化的Transwell@、Millicell@等產品。其高分子膜材料通常使用半透明的聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)，或透明的聚酯(Polyester，PET)和聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)等膜材料。在這類膜材料上，Caco-2腸道細胞至少需要培養21天，才能充分分化并表達出較為接近人體小腸上皮的功能。因此這種培養模型仍需投入大量的人力、物力與時間，同時也增加了細胞在培養過程中受到污染的危險，而且其實驗通量仍不夠高，導致其應用仍存在一定的限制。

針對傳統的Caco-2細胞模型培養周期過長的問題，也有不少研究者開發了Caco-2細胞加速培養模型。比如，通過在培養基中添加生長因子，可在9天內形成完整的Caco-2細胞單層模型(馬美湖，現代食品科技，2016,32，265-270)。黃民等人(中國發明專利，申請公布號CN102533927A)在Transwell板上加入鼠尾膠原鋪板，并在板下腔加入基礎培養基，前3天每天更換培養基，后3天加添加有MIOT的分化培養基，培養6天后，獲得形成緊密單層的Caco-2細胞。這些研究仍然是基于傳統的Caco-2細胞模型Transwell，在培養基中添加價格不菲的組分，或是對Transwell的濾膜進行膠原鋪板修飾，來促進Caco-2細胞快速形成單層細胞結構。總的說來，目前使用和構建的Caco-2細胞培養模型仍需較長的培養周期；而相關縮短Caco-2細胞培養周期的探索中使用了昂貴的生長因子等，使整個基于Caco-2細胞的體外腸道吸收模型成本居高不下。

因此，急需一種培養周期短且成本低的Caco-2細胞體外腸道吸收模型構建方法。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種體外腸道模型的構建方法，以靜電紡纖維膜為Caco-2細胞培養的載體材料，為Caco-2細胞提供理想的黏附、鋪展和生長的仿生微環境，促進Caco-2細胞在靜電紡纖維膜上快速貼壁生長，并形成完整細胞單層，分化出小腸上皮細胞的生物功能，從而具備模擬腸道吸收的功能，發揮對藥物和營養物質等組分的吸收轉運代謝的生理功能，用于快捷、準確評估營養物質和藥物的吸收能力和生物利用度。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

本發明的目的之一在于提供一種體外腸道模型的構建方法，以靜電紡納米纖維膜為Caco-2細胞的載體材料，將Caco-2細胞接種到該材料表面，培養直至形成完整的Caco-2細胞層并分化出小腸絨毛，獲得具備完善的生物活性和生理功能的體外腸道模型。

作為本發明優選的方案，將靜電紡納米纖維膜材料固定到上下腔室中間作為隔層材料，然后將Caco-2細胞接種到該材料表面培養3-4天形成完整的Caco-2細胞層，并獲得具備完善生物活性和生理功能的體外腸道模型。