[發(fā)明專利]一種測定吸煙者尿液中尼古丁和可替寧的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811216023.0
• 申請日: 2018-10-18
• 公開（公告）號(hào): CN109061012B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李晶;李雪梅;楊光宇;劉欣;楊葉昆;陳建華;張承明;耿永勤;米其利;向明
• 申請（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14
• 代理公司: 北京市領(lǐng)專知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11590
• 代理人: 任文娟;陳有業(yè)

本發(fā)明提供了一種測定吸煙者尿液中尼古丁和可替寧的方法，包括如下步驟：(1)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立：配制標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，并以實(shí)際尿液樣品為基質(zhì)進(jìn)行混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，利用UPLC?MS/MS分析并建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；(2)收集尿液樣品，并進(jìn)行前處理，利用甲醇和水調(diào)節(jié)尿液的穩(wěn)定性；(3)將步驟(2)調(diào)節(jié)后的尿液樣品過濾，利用UPLC?MS/MS對(duì)尿液樣品進(jìn)行檢測，根據(jù)步驟(1)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算吸煙者尿液樣品中尼古丁和可替寧含量。本發(fā)明采用甲醇替代硫酸氫鈉來調(diào)節(jié)尿液的穩(wěn)定性，避免加入硫酸氫鈉所造成的基質(zhì)效應(yīng)，大大提高了質(zhì)譜檢測器靈敏度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于煙草煙氣暴露生物標(biāo)記物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種測定吸煙者尿液中尼古丁和可替寧的方法。

背景技術(shù)

吸煙與健康是當(dāng)今世界最受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一，而科學(xué)測量煙草暴露是研究煙草暴露與健康相關(guān)性的基礎(chǔ)。尼古丁及其代謝物可替寧是評(píng)價(jià)煙草暴露的關(guān)鍵生物標(biāo)記物，可通過尿液、血液、唾液和頭發(fā)等生物材料中的尼古丁和可替寧的測定評(píng)估人體煙草暴露的劑量和程度。尿液樣本采集方便，對(duì)受試者侵害性小，是供吸煙與健康研究最理想的生物樣品。因此建立準(zhǔn)確、快速的吸煙者尿液中尼古丁和可替寧檢測方法對(duì)吸煙與健康研究具有重要指導(dǎo)意義。

目前國內(nèi)外對(duì)尼古丁和可替寧的測定方法進(jìn)行過大量研究，方法主要有：酶聯(lián)免疫法(ELISA)、氣相色譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。其中，ELISA法受到基體干擾以及實(shí)驗(yàn)操作影響較大，而GCMS由于要從水相的尿液中進(jìn)行分離提取目標(biāo)物，前處理操作較為復(fù)雜，因此，HPLC法和HPLC-MS/MS法是最常用的方法，而和傳統(tǒng)的HPLC法相比，HPLC-MS/MS法具有更高的靈敏度和選擇性，但是由于尿液樣品內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)和酶，為了進(jìn)行即時(shí)的煙草暴露信息監(jiān)測，必須對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。據(jù)報(bào)道，尿液樣品中尼古丁相對(duì)穩(wěn)定，半衰期較長，但可替寧由于半衰期較短，在尿液中活性酶的作用下會(huì)繼續(xù)分解，1天內(nèi)變化率就達(dá)30％，存在含量不穩(wěn)定的結(jié)果。文獻(xiàn)中采用硫酸氫鈉作為穩(wěn)定劑，但由于采用LC-MS/MS檢測，加入硫酸氫鈉時(shí)會(huì)造成基質(zhì)效應(yīng)，會(huì)使質(zhì)譜檢測器靈敏度大大下降并影響分析結(jié)果。

因此尋找一種有效、方便的尿液穩(wěn)定方法，并通過UPLC-MS/MS進(jìn)行吸煙者尿液中的尼古丁和可替寧含量的測定十分迫切且必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種測定吸煙者尿液中尼古丁和可替寧的方法，其有效解決了現(xiàn)有的尿液中尼古丁和可替寧的測試方法前處理操作復(fù)雜繁瑣、尿液不穩(wěn)定、耗時(shí)長的問題。

一種測定吸煙者尿液中尼古丁和可替寧的方法，包括如下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立：配制標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，并以實(shí)際尿液樣品為基質(zhì)進(jìn)行混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，利用UPLC-MS/MS分析并建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

(2)收集尿液樣品，并進(jìn)行前處理，利用甲醇和水調(diào)節(jié)尿液的穩(wěn)定性；

(3)將步驟(2)調(diào)節(jié)后的尿液樣品過濾，利用UPLC-MS/MS對(duì)尿液樣品進(jìn)行檢測，根據(jù)步驟(1)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算吸煙者尿液樣品中尼古丁和可替寧含量。

上述測定吸煙者尿液中尼古丁和可替寧的方法，步驟(1)包括如下具體步驟：

a、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：準(zhǔn)確稱取尼古丁和可替寧標(biāo)準(zhǔn)品各0.1g于100mL的2個(gè)容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；使用時(shí)用甲醇稀釋成0.01mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；

b、內(nèi)標(biāo)工作液的配制：準(zhǔn)確稱取d⁴-尼古丁和d³-可替寧標(biāo)準(zhǔn)品各0.05g于100mL的2個(gè)容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到5.0mg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液；