[發(fā)明專利]一種CD3E基因修飾人源化動物模型的構(gòu)建方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811215735.0 | 申請日： | 2018-10-18 |
| 公開（公告）號： | CN109355309B | 公開（公告）日： | 2021-02-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 趙靜;琚存祥;張明坤;賈冬景;侯歡歡;高翔 | 申請（專利權(quán)）人： | 江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京天盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11421 | 代理人： | 孫倩倩 |
| 地址： | 210032 江蘇省南京*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 cd3e 基因 修飾 人源化 動物 模型 構(gòu)建 方法 | ||
1.一種CD3E基因修飾人源化動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)通過PCR擴(kuò)增制備FRT-Neo-FRT片段：其中PCR擴(kuò)增FRT-Neo-FRT片段所使用的引物為：F：GCAACTAAAAGTATAGGAACCGCACATTTCAGACCAAGAATTAAATCAGTGGCTGTCCACTGTGGCAACGACGGTATCGATAAGCTTGA(SEQ ID NO：1)；R：TAACTGAAAGTAAAGAGAGGACTGCGGGAGTTTGGGACCTTTGTGCAGACGTGCTCATGCTCGTTCGATTATGTACCTGACTGATGAAG(SEQ ID NO：2)；
(2)將含有人源CD3E及其調(diào)控序列的BAC載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，所述BAC載體中保留了人源CD3E基因的調(diào)控區(qū)域，保證了人源CD3E表達(dá)受人類自身啟動子和調(diào)控序列控制；
(3)將步驟(1)制備的FRT-Neo-FRT片段電轉(zhuǎn)化入步驟(2)所得的大腸桿菌，經(jīng)鑒定獲得含有人源CD3E基因和FRT-Neo-FRT片段的載體hCD3E-BAC-FRT-Neo-FRT；
(4)去除hCD3E-BAC-FRT-Neo-FRT上的Neo基因，進(jìn)行鑒定確認(rèn)，獲得最終的打靶載體；
(5)采用DNA原核顯微注射法，將構(gòu)建好的攜帶人源CD3E序列的打靶載體注射入小鼠受精卵中，移植入受體母鼠生產(chǎn)CD3E基因修飾人源化動物模型，其中所述小鼠為BALB/c小鼠，所述人源化動物模型實(shí)現(xiàn)了人源CD3E(hCD3E)及鼠源CD3e(mCD3e)共表達(dá)，且免疫系統(tǒng)健全。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其中所述大腸桿菌為EL250。
3.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其中步驟(1)具體為：以質(zhì)粒PL451為模板，高保真酶PCR擴(kuò)增FRT-Neo-FRT片段，回收定量。
4.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其中步驟(2)具體為：
a)將準(zhǔn)備好的含有人源CD3E及其調(diào)控序列的BAC載體加入已經(jīng)制備好的電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌中，混勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，準(zhǔn)備另一組1.5ml離心管，作好標(biāo)記并加入1ml預(yù)熱的無抗性LB備用；
b)電轉(zhuǎn)儀調(diào)至如下參數(shù)：1750V，將電轉(zhuǎn)杯外側(cè)擦拭干凈，放入電擊槽，按下電擊按鈕，聽到輕微的聲音響起即放開，示數(shù)在5ms；
c)吸取準(zhǔn)備好的LB將經(jīng)過電轉(zhuǎn)杯中的菌體沖洗出來，加入準(zhǔn)備好的1.5ml離心管中的LB培養(yǎng)液內(nèi)，30℃振搖1小時，同時將平板放入30℃恒溫箱預(yù)熱；
d)1小時后，直接吸取100μl涂在其中一塊平板，將剩下的900μl 6000rpm離心1min后，倒掉多余的上清，留下100μl重懸菌體，均勻地涂在另一個平板上，作好標(biāo)記；
e)將平板倒放在30℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，從過夜培養(yǎng)的平板中挑取單克隆并進(jìn)行鑒定，得到含有hCD3E BAC的大腸桿菌備用。
5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，步驟e)中鑒定克隆時使用的引物由如下表所示的引物組成：
6.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其中步驟(3)中鑒定時使用的引物由如下表所示的引物組成：
7.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其中步驟(4)中鑒定時使用的引物由如下表所示的引物組成：
8.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其中步驟(5)中CD3E基因修飾人源化動物模型通過PCR進(jìn)行鑒定，使用的引物由如下表所示的引物組成：
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