[發明專利]一種秦嶺石蝴蝶試管內葉插快繁體系的建立方法

在審

• 申請號: 201811213424.0
• 申請日: 2018-10-18
• 公開（公告）號: CN109275564A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 胡選萍;蔣景龍;王琦;李耘;秦公偉;胡鳳成;趙新峰
• 申請（專利權）人: 陜西理工大學;漢中市林業局;略陽縣苗圃
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 李振瑞

本發明公開了一種秦嶺石蝴蝶試管內葉插快繁體系的建立方法，包括外植體葉片的消毒和接種、葉插增殖培養以及生根壯苗培養三個步驟，培養過程中使用基礎培養基，以及附加MS營養液及激素的具體培養基，首先將作為外植體的葉片經過擦拭、震蕩洗滌、沖洗及滅菌去離子水沖洗后葉炳端朝下斜插入基礎培養基中，從葉柄基部添加增殖培養液誘導不定芽形成，最后將形成的不定芽叢分為單株后轉入基本培養基，從單芽根部添加生根壯苗培養液進行生根壯苗。本發明通過組織培養技術實現了秦嶺石蝴蝶的葉插快繁培養，增殖系數高，能夠克服自然繁殖方式較慢的特點，在短時間內獲得大量遺傳性狀穩定一致的優質種苗，對秦嶺石蝴蝶快速繁育與種質資源保護具有積極意義。

技術領域

本發明涉及植物組織培養技術領域，具體為一種秦嶺石蝴蝶試管內葉插快繁體系的建立方法。

背景技術

秦嶺石蝴蝶(Petrocosmea qinlingensis W.T.Wang)為苦苣苔科(Gesneriaceae)石蝴蝶屬(Petrocosmea)植物，是秦嶺地區特有的多年生草本植物，花期8-9月，生于山地巖石上，海拔650米，被列為國家Ⅱ級重點保護野生植物，并被定為瀕危種。秦嶺石蝴蝶是石蝴蝶屬分布最北端的種類，自然居群數量極少，多次野外調查并未發現其野生居群，研究者曾認為該種已滅絕。2015年陜西省野生植物資源調查重新發現了該種，其分布區域非常狹窄，僅限于陜西省勉縣茶店鎮附近，多生于陰濕、苔蘚積聚多的石灰石崖壁上。

自然條件下秦嶺石蝴蝶種子不育，無性繁殖速度又很慢。生境獨特且繁殖方式限制是該種致瀕的重要原因。利用植物組織培養技術進行秦嶺石蝴蝶的快速繁殖，可以在短時間內獲得大量與母株遺傳背景一致的優質種苗，克服自然繁殖方式較慢的特點，但是，在此之前還沒有建立秦嶺石蝴蝶試管內快速繁殖的報道，更沒有成功的實例。所以實現秦嶺石蝴蝶的快速繁殖對于秦嶺石蝴蝶的野外回歸與種質資源保護具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種以帶柄葉片為外植體材料，經過葉片消毒、接種、葉插增殖以及生根壯苗等步驟成功實現秦嶺石蝴蝶的葉插快繁培養，能夠克服自然繁殖方式較慢的特點，在短時間內獲得大量遺傳性狀穩定一致的優質種苗，技術易掌握，增殖系數極高的秦嶺石蝴蝶試管內葉插快繁體系。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案是：

一種秦嶺石蝴蝶試管內葉插快繁體系的建立方法，包括以下步驟：

(1)葉片的消毒及接種：從秦嶺石蝴蝶母株上摘取健康的帶柄葉片為外植體材料，對外植體材料進行清洗和消毒，然后將外植體材料無菌操作下葉柄端朝下斜插入基礎培養基中，基礎培養基由一定體積比的珍珠巖、蛭石和泥炭加水混均后于121.3℃下滅菌60min制得；

(2)葉插增殖培養：從步驟(1)中斜插入基礎培養基的外植體材料的葉柄基部向培養基中添加增殖培養液，誘導不定芽的形成，增殖培養液為MS營養液+IBA，IBA濃度為100～600mg/L，pH值為5.8；

(3)生根壯苗培養：將步驟(2)中得到的不定芽叢分為單株，挑選芽體大于2cm且帶有3～5片葉的單株轉入基礎培養基，從單芽基部向基礎培養基中加入生根壯苗培養液進行生根壯苗，其中生根壯苗培養液為MS營養液+IBA，IBA濃度為200mg/L，pH值為5.8。

優選的，步驟(1)和(3)中基礎培養基的制備過程為：

首先按照2：1：1的體積比量取珍珠巖、蛭石和泥炭并加水混均，待吸水飽和后分別裝入240mL的培養瓶中，裝入體積為培養瓶體積的1/3，然后蓋上透氣蓋，最后將培養瓶于121.3℃下滅菌60min，得到基礎培養基。

優選的，步驟(1)和(3)中MS營養液不加蔗糖，pH值為5.8。

優選的，步驟(1)中外植體材料的清洗和消毒過程為：