[發(fā)明專利]大籽獼猴桃EST-SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811210822.7
• 申請日: 2018-10-17
• 公開（公告）號: CN109055605B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸胤;陸煒強(qiáng);陳川;瑪青;許曉路
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江樹人學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

本發(fā)明公開了一種大籽獼猴桃EST?SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用，大籽獼猴桃EST?SSR分子標(biāo)記是3個具有多態(tài)性的EST?SSR分子標(biāo)記AM?es03、AM?es06和AM?es09，其序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示。本發(fā)明以8個大籽獼猴桃群體及3個同屬親緣關(guān)系較近獼猴桃屬植物基因組DNA模板為研究對象，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列信息，選擇其中以三堿基為重復(fù)基元的SSR位點(diǎn)，采用Primer 5.0設(shè)計EST?SSR引物。經(jīng)過PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳、克隆驗(yàn)證、STR基因分型篩選出3個具有多態(tài)性的EST?SSR分子標(biāo)記，能夠有效、快速地鑒別貓人參藥材的基源植物大籽獼猴桃與其近源種。這些分子標(biāo)記可用于大籽獼猴桃的種質(zhì)鑒定及評價，以及研究種群的遺傳多樣性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子標(biāo)記與藥用植物鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大籽獼猴桃EST-SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

分子標(biāo)記在種質(zhì)資源多樣性研究中有著廣泛的應(yīng)用。DNA水平的多態(tài)性主要表現(xiàn)核苷酸序列的差異，對于任何類型的核苷酸序列的差異都可用分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行檢測。其中簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)又稱微衛(wèi)星序列，是由1～6個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)單元組成的一類DNA序列。SSR標(biāo)記呈現(xiàn)出以下優(yōu)點(diǎn)：(1)廣泛存在于真核生物的基因組中、多態(tài)性豐富；(2)其產(chǎn)物進(jìn)行測序凝膠電泳分離時單堿基分辨率高、共顯性標(biāo)記遺傳信息量大；(3)呈孟德爾式遺傳，具有很好的穩(wěn)定性，DNA用量少，技術(shù)要求低，成本低廉，PCR擴(kuò)增的可重復(fù)性高。因此，SSR標(biāo)記是目前最具應(yīng)用價值的分子標(biāo)記之一，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因的快速定位、指紋圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建以及分子標(biāo)記輔助選育及種質(zhì)鑒定等研究。然而，SSR標(biāo)記物種特異性一定程度上限制了其引物的通用性，有限的基因序列資源依然是SSR標(biāo)記開發(fā)的瓶頸。

2005年以來，第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展為規(guī)?；z傳變異檢測和標(biāo)記位點(diǎn)開發(fā)帶來了新機(jī)遇。SSR可從表達(dá)序列標(biāo)簽(Express sequence tag，EST)庫或轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中挖掘，稱之為EST-SSR。與基因組SSR相比，EST-SSR開發(fā)相對較易，但其多態(tài)性相對較低。篩選高多態(tài)性的EST-SSR分子標(biāo)記對于遺傳研究與種質(zhì)資源評價均具有重要的價值。目前，基于轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行SSR標(biāo)記引物開發(fā)在忍冬(Lonicera japonica)、丹參(Salviamiltiorrhiza)、紅豆杉(Taxus cuspidata)、三七(Panax notoginseng)、紫蘇(Perillafrutescens)和杜仲(Eucommia ulmoides)等藥用植物上得到有效應(yīng)用。

中國是獼猴桃屬植物的起源、進(jìn)化及分布中心，其遺傳資源極為豐富，占全世界獼猴桃遺傳資源種屬總數(shù)的96％。由于獼猴桃屬植物現(xiàn)行分類的主要依據(jù)是少數(shù)一些表觀性狀，而形態(tài)性狀本身易受環(huán)境的影響；加之該屬物種間自然雜交和種質(zhì)滲入頻繁，且染色體倍性復(fù)雜，致使對一些種的界定模糊，系統(tǒng)位置難于確定。其中，大籽獼猴桃(Actinidiamacrosperma)特產(chǎn)于我國，主產(chǎn)于浙江、江西、安徽等地，為華東地區(qū)常用大宗藥材“貓人參”的基源植物(俗稱“紅貨”)，收載于《中藥大辭典》等中藥典籍，具有清熱解毒、消腫癤等功效，臨床用于治療骨髓炎、肺癌深部膿腫、消化系統(tǒng)腫瘤和肝硬化黃疸腹水等，連續(xù)數(shù)年位居抗腫瘤配方中的前十名。市場調(diào)查結(jié)果顯示，大籽獼猴桃藥材資源的巨大消耗，市場上正宗“紅貨”幾乎告罄，除臨床用量需加倍的“白貨”對萼獼猴桃(A.valvata)外，黑蕊獼猴桃(A.melanandra)、中華獼猴桃(A.chinensis)、小葉獼猴桃(A.lanceolata)、毛花獼猴桃(A.eriantha)等同屬近緣種、甚至其它不同科植物被紛紛混充作貓人參流入市場，成為其在生產(chǎn)和臨床上面臨的較突出問題。