[發明專利]一種應用Cas9技術制備CKO/KI動物模型的方法

有效

• 申請號: 201811208538.6
• 申請日: 2018-10-17
• 公開（公告）號: CN109266680B
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 琚存祥;趙靜;張明坤;李松;侯歡歡;高翔
• 申請（專利權）人: 江蘇集萃藥康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 孫倩倩

本發明涉及一種應用Cas9技術制備CKO/KI動物模型的方法。該方法采用體外表達純化的Cas9蛋白、預先用胚胎進行sgRNA切割效率測試篩選出的高效率sgRNA、以及單鏈DNA作為打靶載體，將三者混合后進行胚胎注射及移植；移植后生出的小鼠標記為F0，將F0進行基因型鑒定，對已經性成熟且基因型鑒定正確的F0進行配繁，其后代小鼠標記為F1，對F1小鼠進行分析驗證，基因型驗證正確的F1小鼠即為制備的CKO/KI動物模型。本發明方法流程完善，可以同期開展多項技術服務，滿足不同定制化需求，解決了Cas9‐mRNA質量較難控制、sgRNA體內切割效率未知、雙鏈打靶載體隨機插入等問題，降低了實驗成本。

技術領域

本發明涉及一種Cas9技術應用于動物模型的制備方法，特別是一種CKO/KI動物模型的制備方法。

背景技術

CKO/KI動物模型一直以來是研究基因功能、篩選藥物的重要工具。但是傳統的制作方法需要通過復雜的打靶載體構建、ES細胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、對技術的要求很高，而且費用大，耗時較長，成功率受到多方面因素的限制。即使對于技術比較成熟的實驗室，利用傳統技術構建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。

CRISPR/Cas9是2013年出現的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。在這一系統中，crRNA(CRISPR‐derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans‐activating RNA)結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA，產生雙鏈斷裂(DSB：Double‐strand break)，細胞通過非同源或同源末端連接(NHEJ：nonhomologous DNA end joining；HR,homology‐directed repair)的方式對斷裂的雙鏈進行修復，從而實現基因組的精確編輯，如：條件性基因敲除、基因敲進、基因替換、點突變等。

CRISPR/Cas9技術是繼鋅指核酸酶(ZFN)、ES細胞打靶和TALEN等技術后可用于定點構建基因修飾動物的第四種方法，且有效率高、速度快、簡單經濟及生殖系轉移能力強等特點，在動物模型構建的應用前景非常廣闊。

目前國內、外各實驗室和公司在使用CRISPR/Cas9技術時，一般通過體外轉錄的Cas9‐mRNA轉入胚胎內表達Cas9蛋白，但體外轉錄的Cas9‐mRNA在胚胎內的蛋白表達效率受體外轉錄的mRNA質量影響，進而影響打靶效率。除此之外，打靶效率也受sgRNA切割效率高低的影響，而網站預測的sgRNA活性評分并不能反映出sgRNA在胚胎內的真實切割效率。另外，CRISPR/Cas9技術所伴隨的雙鏈打靶載體隨機插入問題也是不可忽略的，不過，大量的研究表明，以單鏈DNA為修復模板的模式可以降低隨機插入率。

這一流程存在的Cas9‐mRNA質量較難控制、sgRNA體內切割效率未知、雙鏈打靶載體隨機插入的問題，則增加了實驗成本和時間，限制了技術的廣泛應用。

發明內容

為解決上述問題，本發明將Cas9‐mRNA替換為體外表達純化的Cas9蛋白，可一次制備獲得大量Cas9蛋白，通過活性切割的蛋白即可應用于生產；同時，為了保證項目成功率，先用胚胎進行sgRNA切割效率的測試，篩選出高效率的sgRNA。另外，我們使用單鏈DNA作為打靶載體，很大程度上降低了隨機插入率。

本發明旨在利用CRIPSR/Cas9基因編輯技術，以體外表達獲得的蛋白和通過胚胎篩選獲得的高效sgRNA組合，實現基因組多位點打靶，對靶基因上的多個位點實行剪切，實現基因組改造的目的。