[發(fā)明專利]一種羥基自由基的比色檢測方法及其應用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811201942.0 | 申請日： | 2018-10-15 |
| 公開（公告）號： | CN109060694B | 公開（公告）日： | 2021-01-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 劉芳;鄧濤;胡世友 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣州中醫(yī)藥大學（廣州中醫(yī)藥研究院） |
| 主分類號： | G01N21/31 | 分類號： | G01N21/31;G01N1/28 |
| 代理公司： | 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202 | 代理人： | 顏希文;宋靜娜 |
| 地址： | 510000 廣東省*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 羥基 自由基 比色 檢測 方法 及其 應用 | ||
本發(fā)明公開了一種羥基自由基的比色檢測法及其應用，屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，檢測試劑中的硝基咪唑與·OH自由基反應釋放亞硝酸根，亞硝酸根與Griess試劑反應生成的紅色偶氮產(chǎn)物在540nm處具有最大吸光值；該檢測方法不僅可以通過UV?Vis，還可以通過簡單的肉眼識別來檢測·OH自由基的濃度；另外，本發(fā)明還提供了一種簡單、直觀且易于商品化的試劑盒。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種羥基自由基的比色檢測方法及其應用。
背景技術(shù)
活性氧(ROS)由氧氣還原形成，其分為自由基氧和非自由氧兩大類。ROS在環(huán)境和生物過程中起重要作用，其中，羥基自由基(·OH)具有最強的反應活性，因此也常被認為是對生物體最具危害性的活性氧。·OH自由基可導致細胞中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和其他生物分子的氧化損傷。過量接觸·OH自由基會導致細胞死亡，這一過程通常與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)1。但是，·OH自由基并不總是有害的，利用·OH促進物質(zhì)的氧化降解是消除環(huán)境污染的重要方法，如通過光電反應產(chǎn)生的·OH自由基可用于水體中有機污染物的降解。此外，·OH自由基是癌癥放射治療(例如X-ray)過程中的主要活性氧成分之一，其起到殺死腫瘤細胞的作用2-3。因此，·OH自由基的檢測至關(guān)重要。
由于羥基自由基壽命極短且反應過程不易控制，這給·OH的檢測帶來困難4。目前國內(nèi)外已經(jīng)建立了若干種·OH自由基的檢測方法，其包括電化學法5-6、電子自旋共振法(EPR)7-8、化學發(fā)光法9-11、紫外-可見光譜法和熒光光譜法12-16以及基于納米顆粒的熒光探針法17-21。基于電化學和電子自旋共振的檢測方法，因其選擇性差以及操作過程復雜等原因，其在實際檢測中并不常用。近年來發(fā)展起來的基于熒光的檢測方法，雖然具有可在細胞內(nèi)進行檢測的優(yōu)點，但是大多數(shù)熒光體系的建立依賴于復雜的有機合成過程，且檢測高度依賴于儀器的輔助。
紫外-可見光譜法是一種可視化比色檢測法，其已被用于各類檢測物的分析，其中包括活性氧物質(zhì)。前人研究發(fā)現(xiàn)亞甲基藍可被Fenton反應產(chǎn)生的自由基氧化降解形成無色產(chǎn)物，為可視化檢測提供了可能15。金屬染料復合物固藍BB鹽(FBBs)亦可通過與Fenton產(chǎn)生的·OH自由基反應生產(chǎn)無色產(chǎn)物進而實現(xiàn)·OH自由基的檢測14。但是由于反應的復雜性和褪色型方法的固有缺點，這兩種方法的檢測靈敏度非常有限，僅適用于幾十微摩爾每升濃度范圍內(nèi)的檢測。因此，仍然需要更靈敏和更可靠的比色檢測法來實現(xiàn)·OH自由基濃度的測定。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種羥基自由基的比色檢測方法及其應用，該檢測方法更靈敏和更可靠。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種羥基自由基的比色檢測法，其包括以下步驟：
S1)配置羥基自由基標準液；
S2)向羥基自由基標準液和樣品中分別加入硝基咪唑溶液，反應生成亞硝酸根離子；
S3)再將步驟S2反應生成的亞硝酸根離子加入對氨基苯磺酰胺磷酸溶液和N-1-萘基乙二胺水溶液的混合溶液中，室溫避光條件下反應后測定吸光值；
S4)繪制羥基自由基標準液的標準曲線，并計算樣品中羥基自由基的濃度。
本發(fā)明比色檢測方法是在傳統(tǒng)Griess方法的基礎(chǔ)上建立了一種簡單且靈敏的·OH自由基檢測方法nIm-Griess法，檢測過程中使用三種試劑：與羥基自由基反應生產(chǎn)亞硝酸根的硝基咪唑、與亞硝酸根離子反應生成活性重氮鹽的對氨基苯磺酰胺以及與重氮鹽反應形成紅色產(chǎn)物的N-1-萘基乙二胺。在nIm-Griess比色檢測中，羥基自由基與硝基咪唑的硝基取代碳原子發(fā)生加成反應，進而導致亞硝酸根釋放，亞硝酸根可通過Griess試劑進行定量。
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