[發明專利]一種建立缺氧損傷細胞模型的方法

在審

• 申請號: 201811201301.5
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109266598A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 王榮;賈正平;岳新瑞;謝華;李文斌;鹿輝
• 申請（專利權）人: 蘭州軍區蘭州總醫院
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 北京智客聯合知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11700
• 代理人: 李戍

本發明公開了生物醫藥技術領域的一種建立缺氧損傷細胞模型的方法，該建立缺氧損傷細胞模型的方法步驟如下：S1：細胞培養；S2：細胞鋪板；S3：培養基更換；S4：細胞缺氧培養：在培養容器上覆蓋一層透氣膜，置于含有一定氣體組分的模塊化培養小室中培養；S5：細胞檢測。本方法所建立的缺氧損傷細胞模型，不需要實驗動物參與，建模成本低，對于缺氧應激反應更加靈敏，能夠在分子生物學水平上探討缺氧損傷，能夠為模擬缺氧實驗的進行以及抗缺氧藥物的篩選和驗證提供條件。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體為一種建立缺氧損傷細胞模型的方法。

背景技術

缺氧是指因組織的氧氣供應不足或用氧障礙，而導致機體的代謝，功能和形態結構發生異常變化的病理過程。腦，心臟等生命體重要器官缺氧也是導致機體死亡的重要原因，另外，由于動脈血氧含量明顯降低導致的組織供氧不足會導致低血氧癥。

機體正常的生命活動都離不開氧氣，從細胞的新陳代謝到心臟跳動都與氧氣密切相關。機體吸入氧氣，并通過血液到達組織，最終被細胞所感受和利用，因此，缺氧的本質是細胞對低氧狀態的一種反應和適應性改變，當急性嚴重缺氧或者中毒性缺氧時，細胞變化以線粒體能量代謝障礙為主，慢性輕度缺氧時細胞以氧感受器的代償性調節為主。

隨著對缺氧認識和研究的深入，探討缺氧造成的病理性損傷機制與藥物對其作用的靶點，越來越需要在分子生物學的水平上闡明缺氧的細胞損傷機制。缺氧性細胞損傷主要以細胞膜，線粒體，溶酶體等細胞器為主。細胞內嚴重缺氧時造成ATP減少，細胞內膜對離子通透性升高，導致離子順濃度差透過細胞膜，鈉離子內流從而造成細胞水腫。血管內皮細胞水腫會堵塞微血管，進一步造成微循環缺氧，同時鉀離子外流，導致細胞合成代謝障礙，酶的生成減少，將進一步影響ATP的生成和離子泵的功能。當線粒體部位氧分壓降到監界點0.1kPa（＜1mmHg）時，線粒體的呼吸功能降低，關鍵脫氫酶活性下降，ATP生成減少。嚴重時線粒體可出現腫脹、嵴崩解、外膜破裂和基質外溢等病變。缺氧時因糖酵解增強，乳酸生成增多，以及脂肪氧化不全使其中間代謝產物酮體增多。導致酸中毒。pH降低可引起磷脂酶活性增高，使溶酶體膜磷脂被分解，膜通透性增高，結果使溶酶體腫脹、破裂，和大量溶酶體酶的釋出，進而導致細胞本身及其周圍組織的溶解、壞死。

高原是一種特殊的地理環境，其主要環境特征即為低壓低氧。隨著高原旅游的熱潮，國家發展戰略的實施等諸多原因，由平原急進入高原地區的人群逐漸增加，基于上述缺氧造成的細胞損傷機理，部分人體在急進高原后出現嚴重的急性高山病癥狀，包括高原腦水腫，肺水腫等，嚴重時危及生命。

目前急性高山病發病機理復雜，制約了高原合理用藥以及相關藥物的研發。對缺氧損傷病理機制的研究更需要在在缺氧模型的基礎上進行探討。對現有技術來說相關的抗缺氧藥物的都基于動物實驗進行研發，如專利申請號201610616740.7公布的Atropurpuran衍生物組合物在抗缺氧藥物中的應用，其中具體實施例中所提到的缺氧模型使用的是昆明系小鼠，這對動物造成損害。另外以也有直接將細胞置于低氧環境下培養，模擬缺氧狀態的模型，但這種模型的缺點在于，細胞本身較為敏感，其正常需氧量在1%~5%，由于細胞培養瓶在放入缺氧環境中時，瓶中就含有正常大氣中21%的氧氣，且培養瓶為密閉，無菌環境，其中所含氧氣足以維持細胞在一定時間內的正常生存環境，這種細胞模型并不能靈敏地反映細胞缺氧損傷，因此，需要一種更加方便，精準的篩選或驗證治療缺氧損傷的藥物試劑的方法，并且必須建立在分子生物學水平上探討缺氧損傷，才能為模擬缺氧實驗的進行以及抗缺氧藥物的篩選和驗證提供條件。

發明內容

本發明的目的在于提供一種建立缺氧損傷細胞模型的方法，以解決上述背景技術中提出的需要更加靈敏，簡單，穩定的優勢，能夠快速模擬細胞缺氧環境，反映急進缺氧環境后細胞周圍的氧分壓變化以及細胞損傷的狀態方法的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種建立缺氧損傷細胞模型的方法，該建立缺氧損傷細胞模型的方法步驟如下：