[發明專利]檢測樣本中PRCC-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201811198780.X
• 申請日: 2018-10-15
• 公開（公告）號: CN109355382A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 牛林梅;吳鵬飛;王淑一
• 申請（專利權）人: 福州艾迪康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11;C12Q1/6851
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍

本發明公開用于檢測樣本中PRCC?TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和試劑盒，其包括針對1型PRCC?TFE3的上下游引物和探針，針對2型PRCC?TFE3的上下游引物和探針，針對3型PRCC?TFE3的上下游引物和探針，針對4型PRCC?TFE3的上下游引物和探針，以及針對β?actin內參基因的上下游引物和探針。本發明可快速檢測樣本中是否存在PRCC?TFE3融合基因及其表達量的多少。利用本發明完成的檢測結果準確且靈敏，可為人類Xp11.2易位/TFE3融合基因相關性腎癌患者輔助制定個體化治療方案。

技術領域

本發明屬于生物科學和生物技術領域，特別涉及一種檢測樣本中PRCC-TFE3融合基因的方法、寡核苷酸和試劑盒，采用熒光PCR技術，檢測人類Xp11.2易位/TFE3融合基因相關性腎癌患者體內PRCC-TFE3融合基因的表達水平。

背景技術

Xp11.2易位/TFE3基因融合相關性腎癌(簡稱Xp11.2易位性腎癌)是2004年WHO新分類出的一種腎癌獨立亞型，其特征為Xp11.2位點上TFE3基因發生斷裂，并與PRCC、ASPL、PSF、CLTC、NonO等相關基因發生平衡易位形成新的融合基因。據統計，Xp11.2易位性腎癌的發病率在兒童腎癌患者中約占1/3，占45歲以下腎癌的15％，對兒童及青少年患者有極大影響。

TFE3基因的斷裂主要發生在啟動子與主要功能域之間，發生易位的是包含了TFE3功能域的斷裂點端粒側的全部基因，而新的融合基因的啟動子來源于與TFE3基因發生融合的啟動子。在基因組內，與TFE3形成融合的ASPL、PRCC等均屬于管家基因，由于其啟動子的轉錄活性明顯高于原TFE3基因啟動子，使得融合后的TFE3基因表達量升高，因而腫瘤組織高表達TFE3蛋白，這種高表達的TFE3蛋白影響細胞對轉錄調節的干擾作用，促進腫瘤形成。研究發現PRCC-TFE3融合蛋白的轉錄活性大約是野生型TFE3蛋白的3倍，有可能改變轉錄因子的轉錄能力。此外，在與有絲分裂調控點蛋白MAD2B相互作用時，PRCC-TFE3融合蛋白可能還干擾黏合與有絲分裂調控點的功能，導致基因的異常調控，最終形成腫瘤。

Xp11.2易位性腎癌具有特征性的基因改變，其診斷、治療以及預后亦有特殊之處，而其組織形態與腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌較為相似，常規診斷極易誤診和漏診。因此，檢測PRCC-TFE3融合基因對Xp11.2易位性腎癌的分類診斷及個體化治療均有重要意義。

PRCC-TFE3融合基因檢測的常用技術有熒光原位雜交技術(FISH)、實時定量PCR技術(RQ-PCR)等方法。FISH檢測結果較為直觀，但是試驗過程繁瑣，涉及試劑種類繁多，費時費力，且結果需經驗豐富的專業人士來判讀，結果判讀存在較大的主觀性。實時熒光定量PCR中常見的方法有SYBR Green I染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBRGreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。在Taqman技術中，RQ-PCR采用Taqman探針熒光定量技術，綜合生物學、酶學和熒光化學于一體，從擴增到結果分析均在PCR反應管封閉狀態下進行，解決了PCR產物污染而導致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結果用拷貝數表示，實現了對PCR產物的準確定量，易于統一標準，與定性PCR技術相比，具有特異度好，靈敏度高，線性關系好，操作簡單，自動化程度高、防污染，有較大的線性范圍等優點。

發明內容

本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，采用熒光定量PCR技術，利用雙標準曲線的方法，分別構建內參基因β-actin和目的基因PRCC-TFE3的定量標準曲線，檢測目的基因PRCC-TFE3相對于內參基因β-actin的表達水平。通過調整目的基因和內參基因的引物探針比例，以及PCR反應條件，使擴增效率和速率均達到最佳，從而能夠滿足PRCC-TFE3融合基因的檢測，用于評價治療效果、預測預后。