[發明專利]一種黑曲霉發酵秸稈生產檸檬酸的方法

有效

• 申請號: 201811196010.1
• 申請日: 2018-10-15
• 公開（公告）號: CN109735578B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 于有良;劉家印;徐恒德;王學冰
• 申請（專利權）人: 大自然生物集團有限公司
• 主分類號: C12P7/48
• 分類號: C12P7/48;C12P19/14;C12P19/02;C12N9/42;C12R1/685
• 代理公司: 北京金宏來專利代理事務所(特殊普通合伙) 11641
• 代理人: 許振強;苗彩娟

1.一種黑曲霉發酵秸稈生產檸檬酸的方法，特征在于：由秸稈原料預處理步驟、發酵纖維素酶漿液的制備步驟、纖維素酶水解混合物生產步驟、秸稈酶解糖液制備步驟、檸檬酸料液發酵步驟、檸檬酸純化步驟組成；其具體步驟為：

S01步驟，秸稈原料預處理：秸稈經粉碎機粉碎，秸稈長度3-5cm粉碎完成；將粉碎后的秸稈加入稀酸得到纖維素漿液，所述秸稈和稀酸的質量體積比1:4-1:8，所述的稀酸濃度0.63-0.82％；秸稈在稀酸預處理的pH值為2.1-2.4，反應溫度150-180℃，反應時間3-4min，制得纖維素漿液，所述纖維素漿液固液比為1:3-3.7(m/V)；所述稀酸是硫酸、鹽酸、乙酸、碳酸、硝酸；

S02步驟，發酵纖維素酶漿液制備：按重量百分比計，在粉碎的秸稈中加1.6-2.0倍的水調漿，然后添加磷酸二氫鉀0.20-0.25％、硫酸銨0.90-1.20％、蔗糖0.45-0.5％進行混合，調pH值在5.6-6.2，再加入黑曲霉，通風量0.17-0.2VVM，在30±1℃發酵8-10小時得發酵纖維素酶漿液；

S03步驟，纖維素酶水解混合物生產：按重量百分比計，以所述纖維素漿液為底物，添加所述發酵纖維素酶漿液，添加量11.5％，在溫度48-55℃，pH值4.8-5.2條件下反應40-50h，得到纖維素酶水解混合物；

S04步驟，秸稈酶解糖液制備：按重量百分比計，往所述纖維素酶水解混合物中投入3-6倍的秸稈，在溫度30-40℃、pH值5.8-6.2、壓力0.06-0.09MPa發酵50-60h，秸稈酶解糖液制備完成；

S05步驟，檸檬酸料液發酵：將所述的秸稈酶解糖液投入100m³發酵罐，通蒸汽實消至95-100℃，保溫保壓30-40分鐘后，關閉蒸汽通風，通風量400-600m³/h，開冷卻水降溫至37℃，然后以體積百分比10％接種量接入黑曲霉種子液，在溫度36±1℃、pH值5.8-6.2、壓力0.06-0.09MPa進行發酵，在還原糖含量低于0.5％(W/V)后，檸檬酸料液發酵結束。

2.根據權利要求1所述的一種黑曲霉發酵秸稈生產檸檬酸的方法，其特征在于：所述黑曲霉為商購的黑曲霉菌種或者黑曲霉種子液或者黑曲霉孢子懸浮液；

所述黑曲霉按照如下方法培養獲得：

1)土豆汁制備：馬鈴薯200g，水1000mL，將馬鈴薯去皮切碎，煮爛后過濾取得土豆濾液，加入20％蔗糖煮沸，冷卻后待用，土豆汁制備完成；

2)平板培養基：所述土豆汁加入2％瓊脂，121℃滅菌30min后，冷卻到40-50℃后在超凈工作臺上倒平板，冷卻后待用；斜面培養基同上；

3)取Φ20×200mm試管四支，試管內裝9mL蒸餾水，500mL三角瓶1 個，三角瓶內裝30ml蒸餾水，20-30個玻璃珠，滅菌40-60分鐘；

4)用無菌操作法從黑曲霉菌種斜面上取一接種環孢子于三角瓶內，用振蕩法振蕩15-20分鐘；

5)用1mL滅菌細管吸取振蕩后的孢子液1mL于上述滅菌試管中，用手搖勻，連續稀釋2-3支，稀釋液制備完成；

6)吸取稀釋液0.05-0.1mL于空白培養皿中，用玻璃棒涂勻，用牛皮紙包好放入培養室，培養2-3天；

7)從生長好的培養皿中，選取長勢好的單菌落于試管斜面中，放入培養室培養4-5天；

8)取斜面孢子進行搖床鑒定，鑒定產酸10％以上，菌球生長良好后，用于發酵纖維素酶漿液制備；

黑曲霉利用如下步驟獲得：取生產用黑曲霉菌種制作孢子懸液，在無菌環境下用稀釋法將菌種懸液稀釋，然后用吸管或是移液槍轉移到制作好的空白培養皿平板中，保證每個培養皿中單個孢子數在7-10個左右，在適宜的條件下培養，培養完成后挑選形態好的菌落轉移到空白試管培養基中試管斜面培養，試管斜面培養完成后進行搖瓶鑒定，鑒定產酸10％以上，菌球生長良好后，用于發酵纖維素酶漿液制備。