[發明專利]一種腸毒素性大腸桿菌的特異性標記方法

有效

• 申請號: 201811191215.0
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109486844B
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 郭小華;蘇雅婷;梁曉聲;張莉
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京辰權知識產權代理有限公司 11619
• 代理人: 佟林松

1.一種大腸桿菌標記方法，其特征在于將紅色熒光蛋白基因定點敲入大腸桿菌染色體上可插入外源基因的假基因位點處，所述假基因位點處紅色熒光蛋白RFP基因的敲入不改變大腸桿菌的生物學性能；

所述定點敲入使用CRISPR/Cas系統，所述假基因位點為yheO；

所述CRISPR/Cas系統中的向導序列gRNA的核苷酸序列為SEQ ID NO：8。

2.如權利要求1所述的大腸桿菌標記方法，其中所述大腸桿菌為腸毒素性大腸桿菌。

3.如權利要求2所述的大腸桿菌標記方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）腸毒素性大腸桿菌的鑒定；

（2）假基因位點的選擇和驗證；

（3）設計sgRNA靶點引物并構建基因編輯載體；

（4）基因編輯菌株的篩選及基因編輯載體的去除；

（5）RFP基因定點敲入標記的腸毒素性大腸桿菌的驗證。

4.如權利要求3所述的大腸桿菌標記方法，其中步驟（1）包括根據大腸桿菌腸毒素基因保守序列設計引物，以大腸桿菌DNA為模板進行PCR擴增，選擇具有腸毒素基因的大腸桿菌作為進行特異性標記的目標菌株。

5.如權利要求3所述的大腸桿菌標記方法，其中步驟（2）包括參考大腸桿菌K12基因序列，進行生物信息學分析獲得候選假基因位點；根據候選假基因序列設計引物，以步驟（1）中的腸毒素性大腸桿菌基因組為模板進行PCR擴增，確認所述腸毒素性大腸桿菌基因組含有的假基因位點，將其作為紅色熒光蛋白基因定點敲入點。

6.如權利要求3所述的大腸桿菌標記方法，其中步驟（3）包括根據步驟（2）選出并驗證的假基因位點序列設計sgRNA，構建pTargetF-sgRNA載體；通過同源重組構建含有外源基因RFP的基因編輯載體。

7.如權利要求3或6所述的大腸桿菌標記方法，其中所述基因編輯載體構建為通過設計引物利用重疊延伸PCR將T5啟動子、目的基因RFP基因、左右同源臂以及片段J23119(SpeI)-sgRNA-gRNA scaffold相連，最后與Kpn I和Sph I雙酶切線性化載體 pUC57進行連接反應。

8.如權利要求3所述的大腸桿菌標記方法，其中步驟（4）包括制備ETEC-Cas9感受態，將步驟(3)中的基因編輯載體轉化至ETEC-Cas9感受態中，進行基因編輯菌株篩選；經過PCR驗證后，挑選成功敲入的單克隆加入誘導劑，30℃震蕩培養過夜，去除Donor載體；42℃培養處理16 h，去除pCas9載體。

9.如權利要求3或8所述的大腸桿菌標記方法，其中基因編輯菌株的篩選包括將ETEC-Cas9感受態轉化基因編輯載體后分別涂布無抗、Kan抗性、Amp抗性LB平板，編輯成功的克隆在無抗性平板上有菌落生長，在Kan抗性與Amp抗性平板上無菌落生長。

10.如權利要求3所述的大腸桿菌標記方法，其中步驟（5）包括測序驗證RFP基因成功敲入，熒光顯微鏡下驗證紅色熒光蛋白表達。

11.如權利要求1-10任一所述大腸桿菌標記方法制備的紅色熒光蛋白特異性標記的大腸桿菌。

12.如權利要求11所述標記的大腸桿菌，其特征在于：當在培養基中加入3-7 g/L乳糖進行誘導表達，在熒光顯微鏡下鏡檢可以看到大腸桿菌ETEC活細胞中表達紅色熒光蛋白；采用熒光分光光度計法進行特異性檢測，其檢出限在10⁴ -10⁵ CFU/mL。