[發明專利]CEA與dbpA雙標記結直腸癌檢測試劑的制備方法及使用方法

在審

• 申請號: 201811190720.3
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109116026A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 劉瑞廷;王國榮
• 申請（專利權）人: 劉瑞廷
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 西安東靈通專利代理事務所(普通合伙) 61242
• 代理人: 朱玲

1.CEA與dbpA雙標記結直腸癌檢測試劑的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)用緩沖液稀釋CEA-BSA和dbpA-BSA的包被原，加入到96孔板中，過夜，棄包被液，加入封閉液，封閉，棄掉封閉液，洗滌，真空抽干，冷凍保存；

2)將步驟1)中產物加入帶有濾膜的離心管中離心，再用緩沖液重復洗滌多次，與標記試劑充分混勻，振蕩過夜；

3)將步驟2)中產物分離純化，用洗脫液洗脫，同時收集流出液，逐管測量吸光度，測定蛋白含量，根據所述標記試劑的說明書所提供的公式測定標記率和蛋白回收率。

2.根據權利要求1所述的CEA與dbpA雙標記結直腸癌檢測試劑的制備方法，其特征在于：步驟1)具體過程為：

用50mmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液將CEA-BSA和dbpA-BSA的包被原稀釋成2μg/mL，100μL/孔同時加入到96孔板中，4℃過夜，棄包被液，加入封閉液，37℃封閉2h，棄掉封閉液，洗滌，真空抽干冷凍并于–20℃保存。

3.根據權利要求1所述的CEA與dbpA雙標記結直腸癌檢測試劑的制備方法，其特征在于：步驟2)具體過程為：

將0.5mg步驟1)中產物加入Millipore的帶有濾膜的離心管中，8000r/min離心8min，再用50mmol/L，Na2CO3，pH9.0的標記緩沖液重復洗滌6次，將200μL標記抗體和50μgEu³⁺和Sm³⁺標記試劑充分混勻，25℃振蕩過夜。

4.根據權利要求1所述的CEA與dbpA雙標記結直腸癌檢測試劑的制備方法，其特征在于：步驟3)具體過程為：

標記完成后用SephadexG-50層析柱分離純化，用含0.9％NaCl的50mmol/L的Tris-HCl洗脫液洗脫，同時收集流出液，1mL/管，逐管測量吸光度A280，測定蛋白含量，根據Eu³⁺和Sm³⁺標記試劑盒說明書所提供的公式測定標記率和蛋白回收率。

5.基于權利要求1-4任一項所述的CEA與dbpA雙標記結直腸癌檢測試劑的使用方法，其特征在于：包括以下步驟：

A)用緩沖液將CEA稀釋成梯度系列參考標準溶液，用緩沖液將dbpA稀釋成梯度系列參考標準溶液，分裝，保存備用，檢測CEA和dbpA的標準曲線，用雙對數數學模型擬合；

B)向包被酶聯板上加入步驟A)中產物或待測血清，再加入緩沖液，震蕩溫育，用洗滌液洗滌多次，再加入以緩沖液稀釋的所述步驟4)中產物，震蕩溫育，洗滌液洗滌多次，最后加入增強液震蕩后進行檢測。

6.根據權利要求5所述的CEA與dbpA雙標記結直腸癌檢測試劑的使用方法，其特征在于：所述步驟A)具體過程為：

用含0.2％BSA，0.1％NaN3，50mmol/L的pH7.8Tris-HCl緩沖液，將CEA蛋白稀釋成0、1、5、25、50、250、500、600ng/mL系列參考標準溶液；

將dbpA蛋白稀釋成0、1、10、50、100、500、1000U/mL系列參考標準溶液，每瓶1mL分裝，–20℃保存備用，檢測CEA和dbpA的標準曲線，用雙對數數學模型Log-Logit擬合。

7.根據權利要求5所述的CEA與dbpA雙標記結直腸癌檢測試劑的使用方法，其特征在于：所述步驟B)具體過程為：

向包被酶聯板上加入25μLCEA/dbpA參考標準溶液或待測血清，再加入200μL分析緩沖液，震蕩溫育1h，洗滌液洗滌4次，再加入以分析緩沖液1:50～1:100倍稀釋的Eu³⁺-CEA單克隆抗體與Sm³⁺-dbpA單克隆抗體的混合物200μL/孔，震蕩溫育1h，洗滌液洗滌6次，最后加入增強液200μL/孔震蕩5min后在時間分辨熒光檢測儀上進行檢測。