[發明專利]禽流感分型的可視化芯片

有效

• 申請號: 201811187717.6
• 申請日: 2018-10-11
• 公開（公告）號: CN109161614B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 文翼平;向華;文心田;楊國淋;黃小波;曹三杰;伍銳;趙勤
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6837;C12Q1/682;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一組禽流感病毒分型檢測探針和PCR引物，其特征在于：所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-8所示，所述PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-24所示；

其中，H5亞型探針的序列如SEQ ID NO.1所示，H5亞型PCR引物的序列如SEQ ID NO.9-10所示；

H7亞型探針的序列如SEQ ID NO.2所示，H7亞型PCR引物的序列如SEQ ID NO.11-12所示；

H9亞型探針的序列如SEQ ID NO.3所示，H9亞型PCR引物的序列如SEQ ID NO.13-14所示；

N1亞型探針的序列如SEQ ID NO.4所示，N1亞型PCR引物的序列如SEQ ID NO.15-16所示；

N9亞型探針的序列如SEQ ID NO.5所示，N9亞型PCR引物的序列如SEQ ID NO.17-18所示；

N2亞型探針的序列如SEQ ID NO.6所示，N2亞型PCR引物的序列如SEQ ID NO.19-20所示；

禽流感病毒NP基因探針的序列如SEQ ID NO.7所示，禽流感病毒NP基因PCR引物的序列如SEQ ID NO.21-22所示；

λ定位基因探針的序列如SEQ ID NO.8所示，λ定位基因PCR引物的序列如SEQ IDNO.23-24所示。

2.根據權利要求1所述禽流感病毒分型檢測探針和PCR引物，其特征在于：所述探針的5’端連接有一個氨基。

3.根據權利要求1所述禽流感病毒分型檢測探針和PCR引物，其特征在于：所述PCR引物中的下游引物的5’端帶有生物素標記。

4.一種檢測禽流感病毒的可視化基因芯片，其特征在于：包含基質膜和權利要求1所述禽流感病毒分型檢測探針。

5.根據權利要求4所述的檢測禽流感病毒的可視化基因芯片，其特征在于，所述基質膜為醛基修飾的硅晶片或玻璃。

6.一種如權利要求4所述的檢測禽流感病毒的可視化基因芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)設計探針位置的陣列；

(2)稀釋權利要求1所述禽流感病毒分型檢測探針；

(3)使用芯片點樣系統按照步驟(1)中的陣列對基質膜點上對應的步驟(2)的探針，在芯片背面用記號筆沿著探針陣列畫框；

(4)紫外交聯6～12min，37℃水合過夜；

(5)使用封閉液進行封閉，然后清洗晾干、置于4℃保存備用。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于：步驟(5)所述的封閉液包含：0.2％-1％的BH₄Na和20％-30％的乙醇。

8.一種非疾病診斷目的的禽流感病毒可視化檢測方法，其特征在于：它是使用權利要求4所述的檢測禽流感病毒的可視化基因芯片實現的。

9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

A)DNA擴增：將樣本DNA使用權利要求1所述PCR引物擴增，擴增后將產物混勻；

B)雜交：將A)中混合產物高溫變性5分鐘，立即冰浴3min，滴加到含圍欄固定的芯片陣列區域，靜置，超純水沖洗，室溫下晾干；

C)孵育：在芯片陣列區域加入Nanogold-Streptavidin鏈霉親和素溶液在37℃孵育30min，超純水沖洗，室溫下晾干；

D)銀染：避光加入銀染試劑，靜置，超純水清洗，自然晾干；

E)判讀：對應探針區域出現黑點，即可判定為檢測陽性。

10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于：步驟B)的靜置溫度是35-55℃，靜置時間為60-150min。

11.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于：步驟C)的Nanogold-Streptavidin鏈霉親和素溶液濃度是1-10μg/mL。

12.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于：步驟D)的靜置時間是3-9min。