[發明專利]一種基于SIRP-αD1突變體制備的重組蛋白及應用

有效

• 申請號: 201811187563.0
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109306017B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 王雷;黃蘇萍;尹建河;張楠;董麗莎;趙永浩;湯春;彭繼榮;張曉東
• 申請（專利權）人: 倍而達藥業（蘇州）有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K47/68;A61P35/00
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 趙曉芳

本發明公開了一種基于SIRPαD1突變體制備的重組蛋白及應用，基于對SIRPα膜外端IgV區(SIRPαD1)進行接觸表面氨基酸多點突變獲得突變體I，在突變體I的基礎上對第80位氨基酸天冬酰胺(N)采取去糖基化突變獲得突變體II，偶聯人IgG1?Fc區域進行融合表達獲得重組蛋白CD001/CD002。與野生型或去糖基化單點突變體相比，這些突變體與重組蛋白CD47及多種癌細胞系具有更高的親和力，在蛋白水平及細胞水平上對CD47和SIRPa結合有著更好的阻斷效果；對白血球(紅細胞)無凝血；在功能上，能夠更有效的激活巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬。CD001/CD002具有更好的靶點結合活性、更優的靶點阻斷效果及更強的免疫激活功能，而對紅細胞無副作用。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種基于SIRP-αD1突變體制備的重組蛋白及應用。

背景技術

CD47也被稱為整合素相關蛋白(integrinassociatedprotein，IAP)，廣泛的表達于細胞的表面，可與信號調節蛋白α(Signalregulatoryproteinα,SIRPα)、血小板反應蛋白(thrombospondin-1,TSP1)以及整合素(integrins)相互作用，介導細胞凋亡、增殖、免疫等一系列的反應。CD47是一個5次跨膜蛋白，分子量在50kDa左右，屬于免疫球蛋白超家族，胞外N端為IgV結構域。CD47在19世紀80年代首次被確認為人類卵巢癌的腫瘤抗原，繼而CD47被發現在多種類型的人類腫瘤中表達，包括急性髓細胞白血病(AML)、慢性髓細胞白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、非霍金性淋巴瘤(NHL)、多發性骨髓瘤(MM)、膀胱癌(BC)和其他實體腫瘤。

CD47是一個自我標記，代表別吃我信號。人體需要20-30萬億的紅細胞，以此保持氧氣有效的運輸到全身各處。紅細胞的生命周期較短,僅有120天，每小時有100億的紅細胞生成，也有無數衰老的紅細胞被巨噬細胞吞噬清除。然而巨噬細胞是如何區分年輕和衰老的紅細胞，只進攻衰老紅細胞的機理卻不為人知。直到2000年，Oldenborg等人證實CD47是細胞表面一個重要的self標記，是調節巨噬細胞吞噬作用的一個重要信號。CD47可以與巨噬細胞表面SIRPα結合，磷酸化其ITIM，隨后招募SHP-1蛋白，產生一系列的級聯反應抑制巨噬細胞的吞噬作用。年輕的紅細胞表達較高的CD47向巨噬細胞釋放自己人，別吃我的信號，而衰老的紅細胞CD47下調，最終被巨噬細胞清除。

腫瘤細胞有一系列躲避人體免疫系統追殺的方案，包括分泌免疫抑制因子、下調MHCI表達，以及上調PD-L1抑制CD8+T細胞活性。聰明的腫瘤細胞當然不會放過CD47這個完美的掩體，它們通過高表達CD47來躲避吞噬。不同的研究表明，幾乎所有的腫瘤細胞和組織都高表達CD47，是對應正常細胞和組織的3倍。通過CD47這個self信號，腫瘤細胞有效的躲避了巨噬細胞的吞噬作用。

多個研究表明在細胞水平上，通過阻斷SIRPα-CD47之間的相關作用可有效激活巨噬細胞對癌細胞的吞噬作用，在體內通過CD47抗體阻斷SIRPα-CD47之間的相關作用可有效的抑制腫瘤在小鼠體內的生長。另外，通過結構學及單點突變(圖1C)研究表明I33、H56、S66能夠影響到SIRPαD1與CD47的結合，在C’Dloop環中，K53、E54可能對與CD47結合后結構的穩定性有一定影響；在SIRPαD1中，存在潛在的N80糖基化，對與CD47的結合可能存在一定的影響。

Fc受體存在于多種免疫細胞表面，這些細胞包括B淋巴細胞，自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞、中性粒細胞等具有免疫保護功能的細胞，Fc與Fc受體結合后可刺激巨噬細胞吞噬病原體或靶細胞以及刺激細胞毒淋巴T細胞，從而介導巨噬細胞或抗體依賴的細胞毒性來殺傷病原體、癌細胞等。