[發明專利]MGMT啟動子區CpG島的甲基化程度檢測方法

在審

• 申請號: 201811187466.1
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109355364A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 王晨;朱沁;范偉兵;王冠;戴春;許強
• 申請（專利權）人: 領星生物科技（上海）有限公司;上海領安生物科技有限公司;啟東領星醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 陸紅杰

本發明公開了一種MGMT啟動子區CpG島的甲基化程度檢測方法，步驟包括：1）重亞硫酸鹽轉化DNA；2）對重亞硫酸鹽轉化后的DNA，使用建庫正向引物和建庫反向引物進行PCR擴增并建庫；3）對步驟2）的擴增產物進行純化，獲得甲基化檢測文庫；4）對所述文庫進行定量并二代測序，獲得MGMT啟動子區CpG島的甲基化程度數據。本發明通過快速靶向捕獲MGMT啟動子甲基化特異檢測區，在一次擴增重亞硫酸鹽轉化的樣本DNA的同時，合并完成建庫，從而縮短了檢測時間，提高了一次檢測的位點數和檢測通量。

技術領域

本發明涉及生物領域，特別是涉及MGMT啟動子區CpG島的甲基化程度檢測。

背景技術

人腦膠質瘤是一種常見的原發性惡性顱內腫瘤。化療是治療腦膠質瘤的一種方法。腫瘤對化療的耐受是影響化療效果的重要因素之一。DNA修復酶——O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine DNA-transferase，MGMT)在膠質瘤組織中的表達與腫瘤的耐藥性相關，MGMT基因啟動子的甲基化程度是決定MGMT表達量的主要因素，可能影響病人的化療效果及其預后。MGMT啟動子的甲基化程度越高，對化療藥物的敏感度越好。

MGMT啟動子甲基化多發生于MGMT啟動子區的CpG島。MGMT啟動子區CpG島的甲基化程度檢測，一直以來都是在重亞硫酸鹽（bisulfite）轉化樣本DNA后，通過各種分子生物學技術手段來獲得結果的。其中，主要的檢測方法有以下幾種。

甲基化特異性 PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改進方法是檢測基因甲基化的經典方法。MSP法的原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，將所有未發生甲基化的胞嘧啶都被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不變；然后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物，并進行聚合酶鏈擴增反應(PCR)；最后通過瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態。MSP法的優點是靈敏度較高，應用范圍廣。缺點是：（1）實驗條件要求高，對操作的要求高；（2）電泳分析通量低，且容易分辨不清甲基化和非甲基化擴增片段的區別；（3）檢測的CpG位點少，只能定性，不能精確確定甲基化CpG的比例。

亞硫酸氫鹽處理后測序（bisulfite sequencing PCR，BSP）方法是將重亞硫酸鹽處理的DNA直接用特異引物擴增，引物設計在非CpG區，按C-U/T的序列來設計。BSP法主要用于發現甲基化位點分布，不能直接看電泳結果，需要通過一代測序鑒定序列，而一代測序一次只能鑒定一個克隆，無法一次解析出生物體內的甲基化程度比例。

改進的BSP法使用高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)。由于C-U/T的變化改變了序列的Tm值，這樣可以通過實時熒光定量PCR儀和SYBgreen染料法，來分析最終擴增產物的Tm值。甲基化程度越高，C的含量越高，則Tm值就越高，可以實現快速半定量的甲基化程度分析。該方法的缺點是，擴增容易受到氣溶膠污染的影響，非特異擴增容易改變實際的甲基化比例結果，且不能知道特定甲基化位點的比例，或單拷貝的甲基化連鎖情況。

焦磷酸測序技術（Pyrosequencing）是一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。通過準確定量單個連續的CpG 位點上的甲基化頻率，焦磷酸測序技術本身可以檢測并定量甲基化水平上的細微改變。該方法在序列延伸過程中，根據C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T 比例，因此不同位點的甲基化變異就能被準確檢測。由于焦磷酸測序提供了真實的序列數據，甲基化狀態也就以序列形式呈現。但該方法存在以下缺點：（1）單次檢測通量為24個樣本，帶標準品時就只能檢測22個樣本；（2）由于測序讀長質量的限制，一次只能檢測4個CpG位點；（3）不能分辨單拷貝的基因組DNA分子上的CpG位點的甲基化組合，只能混合分析一個樣本CpG甲基化程度的百分比。

發明內容