[發明專利]一種藍果忍冬基因組DNA提取方法

在審

• 申請號: 201811178205.3
• 申請日: 2018-10-10
• 公開（公告）號: CN109182333A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 霍俊偉;張妍;劉化禹;孫豐;秦棟
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種藍果忍冬基因組DNA提取方法屬于分子生物學，該方法主要包括以下步驟：首先破碎細胞壁和細胞膜，使DNA充分釋放到緩沖液中；其次消除蛋白質、多糖、色素等雜質的干擾；最后防止DNA的降解。用SET核分離緩沖液對樣品進行處理，可以很好的將細胞核與上清液中的多糖和多酚等次生物質分開，在研磨過程中加入的PVP以及在后續過程中加入的β?巰基乙醇，可以有效的防止多酚物質的氧化，氯仿/異戊醇抽提時，中間加入稀釋的CTAB以除去多糖。忍冬科植物葉片中含有豐富的糖類和多酚類物質，這些物質會影響DNA的提取效果，而且對PCR時的Tag酶的活性產生影響，通過這種基因組DNA提取方法，獲得了產量高、質量好的DNA，DNA電泳條帶清晰明亮，無拖尾現象，能夠滿足進一步的分子水平的研究。

技術領域：

本發明屬于分子生物學領域，主要涉及一種藍果忍冬基因組DNA提取方法。

背景技術：

植物DNA提取是一項常規的實驗技術，但是對于多糖和酚類物質含量較高的植物及組織，其提取工作并不容易，可能花去大量的時間和精力而得不到理想的DNA。DNA提取的最根本要求是保持核酸的完整性，基因組DNA產品的分子量應在50kb以上，而在DNA提取過程中，有許多因素能導致DNA降解成小片段，如機械張力或高溫很容易使DNA分子發生斷裂，因此，在操作時應盡可能輕緩、溫和，盡量避免過多的溶液轉移和劇烈的振蕩，以減少機械張力對DNA的損傷。DNA酶可降解DNA，而Ca²⁺和Mg²⁺是DNA酶的輔因子，為避免和鈍化DNA酶的作用，在溶液中常加入EDTA，以螯合Ca²⁺和Mg²⁺。pH值也會影響DNA的產量和質量，如在過酸的條件下，由于DNA脫嘌呤而導致DNA的不穩定，極易在堿基脫落的地方發生斷裂，因此，在DNA 的過程中，應避免使用過酸的條件。

提取植物DNA的過程中最為關鍵的有三個部分，首先破碎細胞壁和細胞膜，使DNA充分釋放到緩沖液中；其次消除蛋白質、多糖、色素等雜質的干擾；最后防止DNA的降解。藍果忍冬葉片富含多糖、多酚等次生代謝產物，這些物質與DNA的不可逆結合會嚴重影響Tag聚合酶的活性。本實驗首先用SET核分離緩沖液對樣品進行預洗，可有效地將細胞核(沉淀中)與上清液中的多糖及多酚等次生物質分開。實驗中發現，預洗后的樣品在進行抽提時，上相顏色明顯變淺，極易與有機相分層，所得DNA外觀質量也有顯著改善。提取液中增加酚類絡合劑PVP和抗氧化劑β-巰基乙醇的用量，可有效地控制酚類物質的氧化褐變及 DNA降解。β-巰基乙醇不但可以作為強還原劑防止多酚氧化，還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵使之失活。大多數的報道是在提取液中加入水溶性PVP，但在實驗中發現，這不能完全解決DNA變褐的問題。而直接在液氮研磨樣品時加入PVP粉末，從根本上解決酚類物質的氧化問題，提取出的DNA呈白色，易溶于雙蒸水中。氯仿/異戊醇抽提時，中間加入一定濃度的CTAB以去除多糖。用高濃度鈉鹽(NaAC)和-20℃冷藏的無水乙醇沉淀DNA。沉淀時間不宜過長，以防止雜質與DNA共沉淀影響純度。本研究針對藍果忍冬葉片組織的特點，對常規CTAB法進行改良，結果獲得了產量高、質量好的DNA，用此方法提取的DNA能夠滿足進一步的分子水平的研究。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種藍果忍冬基因組DNA提取方法，以獲得了產量高、質量好的DNA，滿足進一步的分子水平的研究。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：

1、一種藍果忍冬基因組DNA提取方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)取少量葉片于預冷研缽中，加入少量PVP粉末，液氮研磨后立即加入一定體積SET核分離緩沖液，迅速研磨成勻漿，小心轉入2mL離心管中。一定溫度下靜置10min，離心，棄上清。

(2)沉淀加入一定體積的提前預熱的2×CTAB提取緩沖液，再加入適當體積的β-巰基乙醇，混勻，水浴 1h，期間輕緩，搖動數次。