[發明專利]一種高活性重組人凝血因子IX融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201811171804.2
• 申請日: 2018-10-09
• 公開（公告）號: CN109439679A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 曾凡一;黃淑幀;曾溢滔;嚴紅
• 申請（專利權）人: 上海市兒童醫院;上海滔華生物醫藥科技合伙企業（有限合伙）
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/85;C07K19/00
• 代理公司: 北京文苑專利代理有限公司 11516
• 代理人: 喬志員

1.一種高活性重組人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，包括啟動子，人凝血因子IX蛋白基因，人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因和終止子。

2.根據權利要求1所述高活性重組人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述啟動子是山羊β酪蛋白基因啟動子。

3.根據權利要求1所述高活性重組人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述人凝血因子IX為高凝血活性突變體，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，位置1960-1961位的核苷酸為GC而非CG。

4.根據權利要求1所述高活性重組人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述的凝血因子IX為高活性突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，位置384的氨基酸為A而非R。

5.根據權利要求1所述高活性重組人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述人免疫球蛋白IgG1的Fc段核酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.根據權利要求1所述高活性重組人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述人凝血因子IX基因與人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因之間包括接頭序列。

7.根據權利要求6所述高活性重組人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述接頭是由氨基酸序列(GGGGS)n表示的肽，其中n是1-20的整數，所述的接頭還包含一段柔性多肽EFAGAAAV的肽。

8.一種利用轉基因動物乳腺生物反應器生產高活性重組人凝血因子IX融合蛋白的方法，其特征在于，將含有權利要求1所述高活性重組人凝血因子IX融合蛋白基因的載體經原核顯微注射整合入受精卵使轉基因哺乳動物乳腺表達并分泌所述的外源重組凝血因子IX融合蛋白；所述哺乳動物為小鼠，牛或羊。

9.一種高活性凝血因子IX的突變蛋白的乳腺特異表達載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將凝血因子IX(R384A)突變的人凝血因子IX基因與人IgG1的Fc片段cDNA通過接頭序列連接構建入載體中，得到重組質粒；

(2)將上述重組載體顯微注射導入小鼠受精卵，制備hFIX-Fc轉基因小鼠；

(3)PCR法鑒定陽性小鼠，取陽性小鼠交配繁育，獲得陽性母鼠乳汁；

(4)檢測小鼠乳汁中的hFIX-Fc融合蛋白表達情況。

10.根據權利要求9所述高活性凝血因子IX的突變蛋白的乳腺特異表達載體的制備方法，其特征在于，所述重組載體為真核表達載體pcDNA3.1(-)。