[發明專利]一種利用大腸桿菌生產胞外阿魏酸酯酶的方法

在審

• 申請號: 201811169261.0
• 申請日: 2018-10-08
• 公開（公告）號: CN109182297A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 徐振上;王婷;劉新利
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/70;C12N15/66;C12P7/42
• 代理公司: 濟南竹森知識產權代理事務所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

1.一種利用大腸桿菌生產胞外阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)制備含有阿魏酸酯酶基因的重組大腸桿菌，所述的阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)將步驟(1)制得的重組大腸桿菌經IPTG或乳糖誘導發酵，經去除菌體，純化，制得阿魏酸酯酶。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，制備含有阿魏酸酯酶基因的重組大腸桿菌的步驟如下：

(i)以噬淀粉乳桿菌CGMCC11056的全基因組序列為模板，PCR擴增阿魏酸酯酶基因；PCR擴增特異引物核苷酸序列如下：

Forward：5`-TATACATATGTCCCGCATTACAATTG-3`

Reverse：5`-TATGCTCGAGGAATAATGGTTTTAAAAAT-3`

(ii)用內切酶NdeI和內切酶XhoI雙酶切步驟(1)制得的PCR產物，插入載體pET22b中，轉化大腸桿菌，制得重組大腸桿菌。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)中，PCR擴增條件：

PCR擴增程序：

94℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環；72℃終延伸5min，16℃保存；

進一步優選的，所述步驟(ii)中，大腸桿菌為Escherichia coli BL21(DE3)。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，誘導發酵步驟如下：

將重組大腸桿菌接種于LB培養基中，35～38℃培養至OD₆₀₀為0.5～0.8，然后加入IPTG至培養基中濃度為0.4～0.8mM，繼續誘導發酵16～24小時；

或者，將重組大腸桿菌接種于含有乳糖的培養基中，35～38℃發酵36～48小時；

優選的，所述步驟(2)中，固液分離為4℃、13000rpm條件下離心15min；

優選的，所述步驟(2)中，純化步驟如下：

將固液分離后的液體經孔徑0.22μm濾膜過濾，制得濾液，然后經Histrap柱分離，PBS緩沖液中4℃下過夜透析，即得。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的Histrap柱分離步驟如下：

用5倍柱體積的超純水過Histrap柱，速度為1mL/min，然后用5倍柱體積的BingingBuffer過柱子，再將濾液過Histrap柱吸附，然后用10倍柱體積的Binding Buffer進行洗脫，再用5倍柱體積的Elution Buffer過柱子，收集洗脫液，即得；

上述Binging Buffer組份如下：20mM磷酸鹽，500mM氯化鈉，25mM咪唑，調節pH為7.4；

Washing Buffer組份如下：20mM磷酸鹽，500mM氯化鈉，50mM咪唑，調節pH為7.4；

Elution Buffer組份如下：20mM磷酸鹽，500mM氯化鈉，500mM咪唑，調節pH為7.4。

6.一種生產阿魏酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)制備含有阿魏酸酯酶基因的重組大腸桿菌，所述的阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)將步驟(1)制得的重組大腸桿菌經發酵培養基培養并誘導阿魏酸酯酶表達，經去除菌體，純化，制得阿魏酸。