[發(fā)明專利]小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建方法及其在造血輔助中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811145477.3
• 申請(qǐng)日: 2018-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN109439613A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾凡一;黃淑幀;薛燕;王沄漢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市兒童醫(yī)院;上海滔華生物醫(yī)藥科技合伙企業(yè)（有限合伙）
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/073
• 代理公司: 北京文苑專利代理有限公司 11516
• 代理人: 喬志員

1.一種小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行：

(1)胎肝基質(zhì)細(xì)胞獲取及體外培養(yǎng)

頸椎脫臼處死孕鼠，無(wú)菌條件下取出胎肝并吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，過(guò)25-35μm濾網(wǎng)制備單細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液分離胎肝單個(gè)核細(xì)胞，按照0.5*10⁶-2*10⁶/cm²的密度接種于培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液上，置于37℃，5％CO₂濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種20-28h后初次換液，此后每2-3天換液，當(dāng)細(xì)胞匯聚程度達(dá)78-82％時(shí)按照1:2傳代培養(yǎng)。

(2)骨髓LK細(xì)胞分離

將雌鼠經(jīng)頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下取出脛骨及股骨，沖出骨髓細(xì)胞，過(guò)25-35μm濾網(wǎng)制備單細(xì)胞懸液，再用淋巴細(xì)胞分離液分離得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞，此后按照磁珠分選試劑盒操作流程分離出Lin^-c-Kit⁺細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

(3)細(xì)胞骨髓腔內(nèi)移植

取1％戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠后剪開膝關(guān)節(jié)處皮膚，用0.5-2mL注射器從開口處刺入脛骨骨髓腔，拔出針頭，再用20-30μL進(jìn)樣器吸取細(xì)胞懸液從剛剛的針孔處插入骨髓腔并注入細(xì)胞，注射骨髓LK細(xì)胞和胎肝基質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)6-12周。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于，所述培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液為高糖DMEM，15％胎牛血清(v/v)，1％青/鏈霉素(v/v)和0.1mMβ-巰基乙醇。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)所述骨髓LK細(xì)胞的注射量為1.7*10⁴個(gè)，胎肝基質(zhì)細(xì)胞的注射量為2.3*10⁵個(gè)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(2)所述濾網(wǎng)孔徑大小為30μm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)所述注射器為1mL注射器，進(jìn)樣器為25μL進(jìn)樣器。

6.權(quán)利要求1制備的小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞在造血輔助中的應(yīng)用。