[發明專利]一種用于均一體系細胞熒光檢測鈣流方法

在審

• 申請號: 201811144857.5
• 申請日: 2018-09-29
• 公開（公告）號: CN110967321A
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 梁鑫淼;王志偉;于廣璞;薛珍珍;單彩龍
• 申請（專利權）人: 泰州醫藥城國科化物生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 李開婧

1.一種用于均一體系細胞熒光檢測鈣流的方法，其特征在于：包括如下步驟：

a. 稱取Amaranth粉末，溶解在FLIPR緩沖液（1xHank’s緩沖液+20 mM HEPES, pH 7.4）中，得到25 mg/ml溶液；

b. 取10 μl Fluo-4AM (2 mM) 和10 μl pluronic acid (20% in DMSO)混勻，加入到10.5 ml FLIPR緩沖液中，再加入10.5 μl小牛血清，

c. 如果細胞像CHO一樣有陰離子泵（organic anion transporter，還需要在FLIPR緩沖液中加入probenecid (終濃度 2.5 mM)

d. 在96孔板的每孔加入100 ul熒光染料溶液，放回培養箱溫浴0.5h-48h后再加入100μl Amaranth溶液，這也是與現有技術的不同之處（以F8NW NO Wash Calcium Assay Kit為例)，目的是為了減小淬滅劑Amaranth對細胞的毒性。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：還包括前期準備步驟和后續FLIPR分析步驟。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述前期準備步驟如下：準備細胞板：將CHO-M5以每孔60000個細胞的密度種在96孔板中（孔板類型為四周黑色，底部透明），培育16-24小時。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述前期準備步驟如下：準備細胞板：將HEK-M4細胞以80000個/孔的密度種在96孔板中（孔板類型為四周黑色，底部透明），培育16-24小時。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述后續FLIPR分析步驟如下：細胞為CHO細胞，將孔板中的培養基全部吸出，加入100 μl的熒光染料溶液，37℃孵育0.5h-48h后，再次吸出孔板里的液體，加入100μl的FLIPR緩沖液（含Amaranth），然后根據實驗需求加入藥物后進行FLIPR分析。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：所述后續FLIPR分析步驟如下：細胞為CHO細胞，將孔板中的培養基全部吸出，加入100 μl的熒光染料溶液，37℃孵育1h后，再次吸出孔板里的液體，加入100μl的FLIPR緩沖液（含Amaranth），然后根據實驗需求加入藥物后進行FLIPR分析。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述后續FLIPR分析步驟如下：細胞為HEK細胞，直接在細胞孔板中加入100μl的熒光染料溶液，37℃孵育0.5h-48h后，根據實驗需求加入藥物后進行FLIPR分析。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述后續FLIPR分析步驟如下：細胞為HEK細胞，直接在細胞孔板中加入100μl的熒光染料溶液，37℃孵育1h后，根據實驗需求加入藥物后進行FLIPR分析。