[發(fā)明專(zhuān)利]一種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)基的液相分離分析方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811144624.5
• 申請(qǐng)日: 2018-09-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110967413A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁鑫淼;王超然;項(xiàng)婷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 泰州醫(yī)藥城國(guó)科化物生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/86
• 代理公司: 南京瑞弘專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 李開(kāi)婧

本發(fā)明提供的一種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)基的液相分離分析方法主要包括以下步驟：（1）蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)基供試溶液的制備；（2）液相分離：采用5μm或10μm XCharge C18填料裝填的250mm×4.6mm高效液相色譜柱，使用含0.1?0.5%三氟醋酸和0?2%甲醇的高比例水相作為起始洗脫溶劑進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為200?400nm，流速0.1?5ml/min，柱溫10?60℃，進(jìn)樣量0.1?100μL。本發(fā)明的有益效果在于：采用極性修飾的反相固定相，以高比例水相起步進(jìn)行等度或梯度洗脫，使其中腺苷和蟲(chóng)草素以外的極性化合物也都能夠得到有效的保留和分離。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)基的液相分離分析方法。

背景技術(shù)

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris L. Link），又名北蟲(chóng)草、北冬蟲(chóng)夏草，屬子囊菌亞門(mén)、核菌綱、球殼目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬真菌。蛹蟲(chóng)草作為蟲(chóng)草屬真菌的模式種，其宿主主要為鱗翅目的蠶蛾科、舟蛾科、天蠶蛾科等，它是由子實(shí)體與菌核（及蟲(chóng)或蛹的尸體部分）兩部分組成的復(fù)合體。經(jīng)研究表明，蛹蟲(chóng)草具有抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理活性，是具有營(yíng)養(yǎng)、保健和醫(yī)療功效的寶貴生物資源，并在2009年被衛(wèi)生部列為新資源食品（現(xiàn)名新食品原料）。

不同于野生的冬蟲(chóng)夏草，蛹蟲(chóng)草可在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生子實(shí)體，例如液體發(fā)酵和以大米為機(jī)制的固體培養(yǎng)方式等，因此其獲得方式更適合工業(yè)化的大量生產(chǎn)，且不會(huì)對(duì)自然資源和植被產(chǎn)生破壞。目前，蟲(chóng)草素、腺苷等核苷類(lèi)成分，仍被作為評(píng)價(jià)蛹蟲(chóng)草質(zhì)量的主要參考指標(biāo)，如申請(qǐng)?zhí)?01310424244.8的專(zhuān)利提出了一種HPLC法分析蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲(chóng)草素含量的方法。

但除此之外，蛹蟲(chóng)草作為一種發(fā)酵產(chǎn)物，其中還含有多種可能具有生物活性的小分子化合物。這些成分與蟲(chóng)草素和腺苷結(jié)構(gòu)較相似，但極性更大，使用傳統(tǒng)的反相色譜柱往往保留弱，得不到有效的分離，成為對(duì)蛹蟲(chóng)草類(lèi)產(chǎn)品的深度功能挖掘和質(zhì)量控制方法研究的瓶頸。如專(zhuān)利CN103308624B提出的冬蟲(chóng)夏草、蛹蟲(chóng)草的HPLC方法，雖然試圖用指紋圖譜的方法更全面的反應(yīng)冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草的成分，但也只定義了5個(gè)特征峰，且在0-5分鐘顯然有很多成分因?yàn)樯V保留不夠而沒(méi)有得到有效分離。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要針對(duì)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)基中的成分極性普遍較大，保留較弱，開(kāi)發(fā)了一種新的分離分析方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛹蟲(chóng)草提取物較全面的分離分析，從而為蛹蟲(chóng)草及其制品的物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究提供新的解決方案。

本發(fā)明提供的一種蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)基的液相分離分析方法主要包括以下步驟：

（1）蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)基供試溶液的制備：

將蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)基冷凍干燥，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，精確稱(chēng)量蛹蟲(chóng)草子實(shí)體凍干粉末，加入去離子水、酸水或濃度為0-100%醇溶劑進(jìn)行提取，提取結(jié)束后過(guò)濾得到澄清濾液，即為蛹蟲(chóng)草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)基供試溶液；

進(jìn)一步地，所述的醇溶劑為甲醇、乙醇、正丁醇或其混合物；

進(jìn)一步地，所述的提取方法可以為加熱回流或超聲提取等常用的樣品提取方式，所用溶劑比為1-30倍量；

（2）液相分離：

優(yōu)選采用5μm或10μm XCharge C18填料裝填的250mm×4.6mm高效液相色譜柱，使用含0.1-0.5%三氟醋酸和0-2%甲醇的高比例水相作為起始洗脫溶劑進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為200-400nm，流速0.1-5ml/min，柱溫1-60℃，進(jìn)樣量0.1-100 μL。

本發(fā)明的有益效果在于：采用極性修飾的反相固定相，以高比例水相起步進(jìn)行等度或梯度洗脫，使其中腺苷和蟲(chóng)草素以外的極性化合物也都能夠得到有效的保留和分離。