[發明專利]可用于細胞內磁共振研究的DO3A型高穩定順磁探針及制備方法

在審

• 申請號: 201811144276.1
• 申請日: 2018-09-29
• 公開（公告）號: CN109096315A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 蘇循成;楊峰
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C07F5/00
• 分類號: C07F5/00;G01N24/10
• 代理公司: 天津耀達律師事務所 12223
• 代理人: 侯力

本發明提供一種可用于細胞內磁共振研究的DO3A型高穩定順磁探針T₁及其制備方法。所述順磁探針T₁的結構式如下：該順磁探針可與蛋白質的特定位點進行選擇性連接。其具有以下優點：a.對巰基具有高度化學反應選擇性；b.電中性，對大分子影響小；c.水溶性好、配位點多、穩定性強、齒合度高并且與稀土離子形成的配合物具有動力學惰性；d.與蛋白的反應活性高；e.剛性強，對大分子固定作用好；f.探針與蛋白質通過穩定的硫醚鍵連接，可以進行細胞內測量。這些優點使其成為蛋白質細胞內磁共振研究的一個重要的工具。

技術領域

本發明屬于化學生物學、細胞生物學和結構生物學領域中的高性能磁探針，即一種以(2,2',2”-(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三)三乙酸為骨架以苯砜基為離去基團的蛋白質定點特異性修飾新型順磁探針。

背景技術

蛋白質的空間結構、動態變化與其生物功能密切相關。通過磁共振方法可以研究蛋白質動態結構與相互作用，并在原子分辨率水平上深層次了解其結構-功能的關系。磁共振研究蛋白質通常需要定點的標記技術，在蛋白質特定位點引入順磁探針，以此開展順磁探針中順磁中心與蛋白質中原子核的作用或者順磁中心-順磁中心的距離變化關系。因此蛋白質定點引入順磁中心需要借助高活性、高選擇性的標記化學反應和高性能的順磁探針。

順磁探針的質量對利用磁技術研究生物大分子的結構與動態學關系起著決定性的作用。順磁探針一般均是一些具有雙功能團的小分子探針，一端用于順磁金屬離子的螯合，另一端則用于與蛋白質連接。將順磁探針與生物大分子連接后，利用順磁效應可以揭示生物大分子的作用機制和作用構象變化、小分子與大分子作用的高分辨結構(參見：J.Biomol.NMR,2010,46:101-112)，這將對有效藥物先導分子進行篩選與優化起到重要的導向作用。

評價一個順磁探針的優劣通常需要考慮以下要素：a.配位穩定性。若標簽與順磁金屬離子配位不穩定，則PRE(順磁弛豫增強)和EPR(電子自旋共振)中會產生很多副作用。b.剛性。當標簽剛性小時，順磁標簽和蛋白質的相對位置會發生變化，導致測得的EPR數據分辨率很差。c.與蛋白質的反應活性。如果反應活性太低，則反應時間會很長，或者需要比較苛刻的反應條件，這會對蛋白質造成非常不利的影響。d.標簽與蛋白連接物的穩定性。細胞內環境復雜，還原性較高，若連接物不穩定，探針將會從蛋白質上面解離。e.探針不能帶正電荷，否則會對研究不利。

Su等(Chembiochem,2006,7:1599–1604.)首先用Ellman’s試劑5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)活化蛋白質的巰基形成二硫鍵，過量的DTNB通過透析除去；之后加入等量的標簽，標簽中的巰基即和活化的二硫鍵反應生成新的二硫鍵，最終把多肽標簽和蛋白質連接起來(反應過程見圖1)。離去的5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNB)呈現明顯黃色，這為反應過程的檢測提供了很大的便利。這種標記方法產率較高(>70％)，因為LBT多肽標簽酸性很強，與蛋白質連接之后其pI值會明顯改變，所以可以通過離子交換色譜柱將連接產物和未連接蛋白質分離。然而，二硫鍵不穩定，這阻礙了此類標簽的廣泛應用。

Prudencio等(Chem.Eur.J.,2004,10(3):3252～3260.)報道了具有兩個活性巰基的化合物L-1(見圖2)，其由DTPA雙酸酐和S-(2-氨乙基)甲烷硫代磺酸反應得到，合成方法簡單。此標簽可以和蛋白質上距離的兩個半胱氨酸殘基同時反應，形成兩個二硫鍵，增加了標簽的剛性，限制了標簽相對于蛋白質的運動。由于和上面相同的原因，即二硫鍵不穩定，該標簽的應用范圍大大受限。

Li等(Chem.Commun.,2012,48:2704–2706.)首次報道了利用末端烯鍵與蛋白質側鏈巰基的邁克爾加成反應將化合物L-2(見圖2)定點標記到蛋白質上，加成產物為硫醚，它可以在還原性環境和堿性條件下穩定存在。然而化合物L-2只有三個配位點，配位不穩定，鑭系金屬離子和其配位以后，還能結合其他配位原子。另外，此標簽剛性很差。