[發明專利]一種利用結構特異性核酸內切酶的基因克隆方法

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• 申請號: 201811142224.0
• 申請日: 2018-09-28
• 公開（公告）號: CN109234296A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 袁慧;田文奇
• 申請（專利權）人: 蘇州博睞恒生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用結構特異性核酸內切酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步驟為：（1）利用引物擴增載體和目標基因，使所述載體和所述目標基因的兩端產生同源區域；（2）將步驟（1）得到的所述載體和所述目標基因混合并雜交配對連接，產生flap 結構，得到帶flap 結構的重組DNA分子；（3）將步驟（2）得到的帶flap 結構的重組DNA分子用結構特異性核酸內切酶Fen1切除，得到含目標基因的帶缺口的重組載體；（4）步驟（3）得到的含目標基因的帶缺口的重組載體轉化大腸桿菌后，所述含有目標基因的重組DNA的缺口被修復好，得到含目標基因的完整重組載體。

2.根據權利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步驟（1）中所述引物的序列特征為：擴增目標基因和載體的正向引物5’端的第1-40位堿基序列是互補配對的，擴增目標基因和載體的反向引物5’端的第1-40位堿基序列是互補配對的；3’端下游堿基序列與所述目標基因和載體的待擴增DNA片段兩端堿基序列配對。

3.根據權利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步驟（1）中所述擴增采用的是聚合酶鏈式反應PCR，擴增反應緩沖液中包括有用于擴增目標基因和載體的正向引物、用于擴增目標基因和載體的反向引物、目標核酸模板分子、DNA聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸。

4.根據權利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步驟（1）中還包括用限制性核酸內切酶Dpn I對擴增后的載體進行消化處理，去除野生型環狀質粒。

5.根據權利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步驟（1）中所述載體和所述目標基因的兩端產生20-40bp同源區域。

6.根據權利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步驟（2）和（3）在同一體系中進行，步驟（2）中的雜交配對連接和步驟（3）中的切除是先在溫度為95度下反應30秒，再在溫度為50-70度下反應3-5分鐘，如此循環10-30次，進行熱循環酶切反應。

7.根據權利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，所述利用結構特異性核酸內切酶的基因克隆方法還包括對含目標基因的完整重組載體的鑒定：挑取單菌落，利用擴增目標基因的引物與Taq DNA聚合酶進行菌落PCR，鑒定含目標基因的完整重組載體的陽性克隆，培養陽性克隆，并抽提含目標基因的完整重組載體。

8.根據權利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，所述利用結構特異性核酸內切酶的基因克隆方法用于基因點突變，包括步驟為：（1）利用引物擴增野生型基因的質粒載體；（2）將步驟（1）得到的擴增后的質粒載體加熱退火產生flap 結構，得到帶flap 結構的突變型質粒載體；（3）將步驟（2）得到的帶flap 結構的突變型質粒載體用結構特異性核酸內切酶Fen1切除，再自我雜交配對，得到含突變型目標基因的帶缺口的質粒載體；（4）步驟（3）得到的含突變型目標基因的帶缺口的質粒載體轉化大腸桿菌后，所述含突變型目標基因的重組DNA的缺口被修復好，得到含突變型目標基因的完整重組質粒載體。

9.根據權利要求9所述的基因克隆方法，其特征在于，步驟（1）中所述擴增采用的是聚合酶鏈式反應PCR，擴增反應緩沖液中包括有用于擴增的正向引物、用于擴增的反向引物、野生型質粒模板分子、DNA聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸；步驟（1）中還包括用限制性核酸內切酶Dpn I對擴增后的載體進行消化處理，去除野生型目標基因的環狀質粒模板。

10.根據權利要求9所述的基因克隆方法，其特征在于，步驟（2）和（3）在同一體系中進行，步驟（2）中的雜交配對連接和步驟（3）中的切除是先在溫度為95度下反應30秒，再在溫度為50-70度下反應3-5分鐘，如此循環10-30次，進行熱循環酶切反應；所述利用結構特異性核酸內切酶的基因克隆方法用于基因定點突變還包括對含突變型目標基因的完整重組質粒載體的鑒定：挑取單菌落，培養陽性克隆，并抽提含突變型目標基因的完整重組質粒載體進行測序，驗證點突變。