[發(fā)明專利]一種檢測(cè)牛布魯氏菌HSP70的間接ELISA的建立方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811141012.0
• 申請(qǐng)日: 2018-09-28
• 公開（公告）號(hào): CN109490541A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳同壘;于秀劍;龐洪澤;李巧玲;杜萬年;肖麗榮;張志強(qiáng);史秋梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北科技師范學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

1.一種檢測(cè)牛布魯氏菌HSP70的間接ELISA的建立方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)制備牛布魯氏菌HSP70融合蛋白，并對(duì)蛋白進(jìn)行純化，獲得純化的蛋白；

(2)以步驟(1)獲得的純化的蛋白為抗原檢測(cè)布魯氏菌血清樣本，同時(shí)確定抗原包被濃度、血清稀釋度、封閉液種類、二抗稀釋濃度以及顯色時(shí)間；

(3)確定間接ELISA的臨界值：臨界值＝平均值+2.58×標(biāo)準(zhǔn)差；平均值為陰性血清間接ELISA結(jié)果的平均值，標(biāo)準(zhǔn)差為陰性血清間接ELISA結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差；間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：布魯氏菌血清樣本的OD值大于等于臨界值判斷為陽性，布魯氏菌血清樣本的OD值小于臨界值判斷為陰性；

(4)分析間接ELISA方法的敏感性和特異性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)牛布魯氏菌HSP70的間接ELISA的建立方法，其特征在于，步驟(1)所述制備牛布魯氏菌HSP70融合蛋白的步驟如下：

1)PCR擴(kuò)增HSP70基因；

2)構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-HSP70；

3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證，獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序；

4)將重組表達(dá)載體pET32a-HSP70轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株，獲得重組表達(dá)菌株pET32a-HSP70/BL21(DE3)；

5)利用IPTG誘導(dǎo)重組表達(dá)菌株，獲得融合蛋白；

6)利用SDS-PAGE分析融合蛋白表達(dá)情況；

7)對(duì)融合蛋白進(jìn)行Westernblot驗(yàn)證。

3.檢測(cè)牛布魯氏菌HSP70的間接ELISA方法在鑒別牛布魯氏菌中的應(yīng)用。