[發明專利]一種調控番茄腺毛形成的基因及克隆方法

有效

• 申請號: 201811126376.1
• 申請日: 2018-09-26
• 公開（公告）號: CN109112124B
• 公開（公告）日: 2021-05-21
• 發明（設計）人: 楊長憲;葉志彪;廖曉利;朱順華;裴利菲;王濤濤;李漢霞
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.一種調控番茄腺毛形成的基因，其特征在于，所述調控番茄腺毛形成的基因lncRNA全長cDNA序列為1266bp；cDNA序列為SEQ ID NO：1。

2.一種如權要求1所述的調控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，其特征在于，所述的調控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，包括：

步驟一：采用paired-end ssRNA-Seq，測定I型腺體毛、Wo基因突變體和野生型對照Ailsa Craig的轉錄組數據；

步驟二：利用TopHat2與參考基因組進行比對，再結合Cufflinks進行轉錄本的拼接，獲得轉錄本；

步驟三：通過去除表達量和可信度低的單外顯子轉錄本、選擇轉錄本長度200bp的轉錄本、篩除與數據庫注釋exon區域有重疊的轉錄本、選擇FPKM≥0.5的轉錄本，確定疑似lncRNAs；

步驟四：利用兩種編碼潛能分析軟件PFAM和CPC，對疑似轉錄本分別進行編碼潛能的預測，取交集，最終獲得lncRNAs。

3.如權利要求2所述的調控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，其特征在于，調控番茄腺毛形成的基因為：lncRNA000100；

所述的調控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，進一步包括：

RNA-seq分別獲得109,747,652、102,356,032、104,576,556、99,279,862、102,811,164、105,689,184原始數據；去除低質量的原始數據，分別獲得高質量的reads數107276494、100109508、102147322、96925110、100477710和103228014；

利用TopHat2與參考基因組進行比對的結果，再結合Cufflinks進行轉錄本的拼接，共獲得70965個轉錄本；

對70965個轉錄本進行進一步分析，通過去除表達量和可信度低的單外顯子轉錄本、選擇轉錄本長度200bp的轉錄本、篩除與數據庫注釋exon區域有重疊的轉錄本、選擇FPKM≥0.5的轉錄本步驟，確定2356個轉錄本為疑似lncRNAs；

分別利用兩種主流的編碼潛能分析軟件PFAM和CPC對2356個轉錄本分別進行編碼潛能的預測，取交集，最終共獲得1303個lncRNAs。

4.一種如權利要求1所述調控番茄腺毛形成的基因在番茄遺傳改良中的應用，其特征在于，所述應用包括：

提取番茄葉片基因組RNA，利用反轉錄酶試劑盒將RNA反轉錄成cDNA；通過PCR擴增得到lncRNA000100產物，經1％瓊脂糖凝膠檢測，用回收試劑盒回收目的片段，用pEasy-Blunt載體克隆，取5μL連接產物進行熱擊處理；轉化大腸桿菌DH5α，涂布于含有氨芐青霉素/異丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖苷(Amp/IPTG/X-gal)的LB固體平板上，37℃培養過夜，挑選藍斑1個和白斑若干，于含Amp 100mg/L的液體LB培養基中，于37℃200r/min振蕩培養過夜，用小量法提取質粒；

將所述質粒用lncRNA000100特異引物進行檢測，對經檢測正確的陽性重組克隆進行序列測定。