[發明專利]一種新型褐藻膠裂解酶Aly08及其應用

有效

• 申請號: 201811117219.4
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109022408B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 李尚勇;韓彥弢;王亞男
• 申請（專利權）人: 青島大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12P19/00;C12P19/12
• 代理公司: 濟南知來知識產權代理事務所(普通合伙) 37276
• 代理人: 于志波

本發明涉及一種具有pH穩定性和熱恢復特性的內切型褐藻膠裂解酶Aly08及其應用。所述褐藻膠裂解酶Aly08氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明提供的褐藻膠裂解酶為人工設計序列，氨基酸序列與已知功能的褐藻膠裂解酶相似度僅為78%。本發明所述的褐藻膠裂解酶最適反應溫度為45℃，具有熱恢復特性，在煮沸5分鐘后，在冰水中孵育40分鐘，可恢復78.3%的活性。最適反應pH為8.3，具有寬廣的pH穩定性（5?10.6）。該酶作用方式為內切，降解主產物為不飽和褐藻膠二、三糖。本發明所述的褐藻膠裂解酶產量大，性質新穎，具有良好的工業化應用潛質。

技術領域

本發明涉及一種具有pH穩定性和熱恢復特性的內切型褐藻膠裂解酶Aly08及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

褐藻膠是多種褐藻的細胞壁主要成分，可占到褐藻干重的20-40%。我國是海藻養殖大國，褐藻膠產量世界第一。褐藻膠由互為差向異構體的α-L-甘露糖醛酸（Mannuronicacid，M）和β-D-古羅糖醛酸（Guluronic acid，G）通過1,4糖苷鍵連接而成的線性多糖。根據排列組合不同，褐藻膠分為多聚甘露糖醛酸片段（PolyM），多聚古洛糖醛酸片段，以及甘露糖醛酸和古洛糖醛酸交替片段（PolyMG）。褐藻膠廣泛應用在化工、醫藥、食品等行業。今年來，越來越多的報道證實通過褐藻膠裂解酶降解而成的褐藻膠寡糖片段具有多種生物學活性，如抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等。并且，不同聚合度的褐藻膠寡糖具有不同的生物學活性，M段寡糖和G段寡糖之間活性也各不相同。利用褐藻膠制備的聚M段寡糖藥物“GV-971”能多靶點的抑制β淀粉樣細胞的聚集和細胞毒性，已完成三期臨床實驗；聚G寡糖能夠與抗生素聯合使用抑制多種臨床多耐藥致病菌。

褐藻膠裂解酶通過β-消除反應催化褐藻膠分子內1，4糖苷鍵的斷裂，產生非還原性末端具有共軛雙鍵的不飽和寡糖。傳統的褐藻膠裂解酶是從海洋動物消化道或海洋細菌的發酵液上清中直接分離提取，受限于天然褐藻膠裂解酶產量低，發展基因工程的褐藻膠裂解酶勢在必行。目前在多糖降解酶數據庫中已有幾百個預測的褐藻膠裂解酶基因，其中部分基因在大腸桿菌或酵母菌中進行了重組表達，并研究了其酶學性質。但是大多數報道的褐藻膠裂解酶熱穩定和熱恢復性較差，容易失活，無法達到工業化應用的要求。因此，尋找具有特殊性質的褐藻膠裂解酶，并研究其降解條件及最終產物具有重要意義。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供了一種具有寬廣pH穩定性和熱恢復特性的堿性內切型褐藻膠裂解酶Aly08及其應用。該酶與已有褐藻膠裂解酶的氨基酸相似度僅為78%。該酶的最適反應溫度為45℃，最適反應pH為8.3；酶液煮沸5分鐘后，放置在冰水中（0℃）孵育40分鐘，可恢復其78.3%的活性。該酶降解方式為內切，降解主產物為褐藻膠不飽和二糖和三糖。

一方面，本發明提供一種新型褐藻膠裂解酶Aly08，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

MLLNKIITTSAIAIFSSFSMAFDLLDWYLSIPLDKGDGYATSIKENELAASYEDDFFYTGSDGGMVFYTPVKGYKTSENTKYVRTELREMLRRGDTSKSTSGAENNWAFSSISSGVQSDFAGIDGTLKATLAVNHVTTTSSNDEQVGRIVVGQIHAKNNEPIRLYYHKLPNNSKGAIYFAHETSKSDGGNETWYNLLGSMVNSSGSLSSTSNPSDGIELNEEFSYDITVNGDSLIVTISQDGSQLAKKTIDMSGSGYDDASNYMYFKAGIYLQDNTSNDDDYAKATFYELSNTHDNYSY

另一方面，本發明還提供一種新型褐藻膠裂解酶Aly08對應的核酸序列，如SEQ IDNO.2所示。

SEQ ID NO.2：