[發明專利]一種表達環氧化物水解酶的工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201811104611.5
• 申請日: 2018-09-21
• 公開（公告）號: CN109182241B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 于慧敏;梁有向;焦松;王苗苗
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/55;C12N15/74;C12P41/00;C12P17/02;C12R1/01
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本發明屬于基因工程技術領域的一種表達環氧化物水解酶的工程菌及其構建方法和應用。所述表達環氧化物水解酶的工程菌，其是將環氧化物水解酶基因轉入紅球菌而得到的。本發明中所構建的工程菌，采用重組紅球菌作為宿主菌，相比于重組大腸桿菌，其表達的環氧化物水解酶的酶活、熱穩定性、pH穩定性、底物耐受性/產物耐受性都有明顯的優勢。利用本發明中的工程菌用于催化生產光學純(R)?ECH，相比于采用相同游離酶進行的催化，(R)?ECH的濃度提高了46％，收率提高了31％。相對于游離酶或者重組大腸桿菌，重組紅球菌的綜合性能優勢明顯，具有良好的工業應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種表達環氧化物水解酶的工程菌及其構建方法和應用。

背景技術

環氧化物水解酶(Epoxide hydrolases)是一類重要的工業酶，可選擇性催化水解外消旋環氧化物而得到手性環氧化物和相應的鄰位二醇，在醫藥、農藥和香料等方面有廣闊的應用前景。環氧化物水解酶廣泛存在于細菌、真菌、動物、植物中，其催化過程不需要金屬離子或者輔酶參與，具有底物譜寬、催化效率高、對映體選擇性高等優點。

手性環氧氯丙烷(ECH)是一種重要的手性合成砌塊，在醫藥、農藥、精細化工等領域有廣泛的應用，比如，(R)-ECH是合成治療心絞痛類藥物(如美托洛爾、阿普洛爾)的關鍵手性中間體，(S)-ECH是他汀類藥物的起始原料之一。目前已有很多研究者利用環氧化物水解酶拆分制備手性環氧氯丙烷。Choi等利用黑曲霉(Aspergillus niger)在環己烷-水(體積比為98:2)的兩相體系中拆分(S)-ECH，底物濃度60mM，ee值大于99％，收率20％(Choi,etal.,1999,J Biosci Bioeng,88:339-341)。Lee等使用畢赤酵母(Pichia pastoris)重組表達來自膠紅酵母(Rhodotorula glutinis)的環氧化物水解酶制備(R)-ECH，底物濃度50mM，ee值100％，收率26％(Lee,et al.,2004,Biotechnology and Bioprocess Engineering,9:62-64)。Woo等利用來源于海洋新鞘氨醇桿菌(Novosphingobium aromaticivorans)的環氧化物水解酶制備(S)-ECH，ECH濃度500mM，ee值大于99％，收率20.7％(Woo,et al.,2010,Journal of Bioscience and Bioengineering,110:295-297)。

由于產環氧化物水解酶野生菌的活性、對映體選擇性和穩定性等問題，反應的底物濃度或者收率通常較低，在一定程度上限制了環氧化物水解酶的工業應用，因此環氧化物水解酶的重組表達和分子改造受到很多研究者的關注。格羅寧根大學對來自放射形農桿菌(Agrobacterium radiobacter)的環氧化物水解酶進行克隆表達和突變改造，使其對多種底物的對映體選擇性大幅提高(EP879890-A1；EP1013768-A1；Van,et al.,2004,CHEMISTRYBIOLOGY,11:981-990)。浙江工業大學將該酶在大腸桿菌中進行克隆表達和定向進化，用于拆分環氧氯丙烷制備(R)-ECH，其活性、對映體選擇性和熱穩定性均有所提高(Jin,et al.,2013,ENGINEERING IN LIFE SCIENCES,13:385-392；CN105734028A)。雖然環氧化物水解酶已被廣泛應用，但為了適應工業催化過程的需求，其穩定性仍有待提高(包括熱穩定性、pH穩定性、底物/產物耐受性等)。