[發(fā)明專利]利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脫氧-2-氨基腺苷的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811103551.5
• 申請日: 2018-09-20
• 公開（公告）號: CN109136314B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊西寧;李濤;邢善濤;王東琨;祁峰;靳海燕;張賽楠
• 申請（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)拓新藥業(yè)股份有限公司;新鄉(xiāng)制藥股份有限公司
• 主分類號: C12P19/40
• 分類號: C12P19/40;C12R1/22
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了利用密西根克雷伯氏菌合成2'?脫氧?2?氨基腺苷的方法，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。該工藝?yán)妹芪鞲死撞暇鸀榫N，利用該菌株濕菌體為酶源將胸苷和2,6?二氨基嘌呤一步轉(zhuǎn)化為2'?脫氧?2?氨基腺苷。與其他工藝相比，本發(fā)明反應(yīng)體系為純化水、合成液中各個(gè)組分明確，利用該方法得到的2'?脫氧?2?氨基腺苷易提取，產(chǎn)品質(zhì)量高，成本低廉且易操作適合工業(yè)化，成品含量≥99.9%，具有明顯市場競爭力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥中生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及嘌呤脫氧核苷的生物合成，具體涉及利用密西根克雷伯氏菌合成2'-脫氧-2-氨基腺苷的方法。

背景技術(shù)

克雷伯氏菌屬(Klebsiella)為革蘭氏陰性桿菌。主要有肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬結(jié)克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。生物學(xué)性狀：為較短粗的桿菌，大小0.5-0.8×1-2um,單獨(dú)、成雙或短鏈狀排列。無芽胞，無鞭毛，有較厚的莢膜，多數(shù)有菌毛。營養(yǎng)要求不高，有普通瓊脂培養(yǎng)基上形成較大的灰白色粘液菌落，以接種環(huán)挑之，易拉成絲，有助鑒別。在腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基上能發(fā)酵乳糖，呈現(xiàn)有色菌落。

具有O抗原與K抗原，后者用以分型。利用莢膜腫脹試驗(yàn)，本屬K抗原可分為82型。肺炎克氏菌大多屬3型和12型；臭鼻克氏菌主要屬4型，少數(shù)為5型或6型；鼻硬結(jié)克氏菌一般屬3型，但并非所有3型均為該菌。本屬細(xì)菌在55℃、30分鐘內(nèi)被殺死，在培養(yǎng)基上可存活數(shù)周至數(shù)月。

2'-脫氧-2-氨基腺苷(dDA)簡稱2-氨基脫氧腺苷，是精細(xì)化工、農(nóng)藥和醫(yī)藥的重要中間體，特別在醫(yī)藥領(lǐng)域，主要用于合成抗艾滋病、抗癌、治療高血壓等方面藥物，應(yīng)用非常廣泛。其合成方法主要為化學(xué)合成法，采用生物合成從胸苷和2,6-二氨基嘌呤直接轉(zhuǎn)化為2'-脫氧-2-氨基腺苷仍然沒有突破性進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述缺陷，本發(fā)明工藝采用密西根克雷伯氏菌為菌種，利用該菌株濕菌體為酶源將胸苷和2,6-二氨基嘌呤轉(zhuǎn)化為2'-脫氧-2-氨基腺苷，工藝簡單，成本低廉且易操作適合工業(yè)化。

本發(fā)明技術(shù)方案轉(zhuǎn)化過程包括：菌體制備、固定化酶制備、酶促反應(yīng)和產(chǎn)品提取等四個(gè)過程。詳細(xì)工藝流程如圖1所示。

微生物信息：本發(fā)明所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名為以及具體實(shí)施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganen sis)已經(jīng)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC No.16111。

保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2018年07月16日。

一、菌體制備

1.1菌體活化及產(chǎn)酶培養(yǎng)

菌種：Klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)

菌株編號：DUR201505001

菌株保藏號：CGMCC16111

活化培養(yǎng)基：酵母膏5g/L、氯化鈉10g/L、蛋白胨10g/L、pH7.0

培養(yǎng)條件：38℃、200rpm、12h

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：酵母膏75g/L、氯化鈉15g/L、玉米漿60mL/L、氯化鈣0.8g/L、七水硫酸鎂0.6g/L、一水硫酸錳0.8g/L、氯化鋅0.1g/L、pH7.0

培養(yǎng)條件：38℃、DO≥50％、14h

1.2菌體收集

產(chǎn)酶培養(yǎng)液離心處理，然后濕菌體用pH 7.0、20mmol/L的磷酸二氫鉀緩沖液洗滌，離心所得濕菌體-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>