[發明專利]一種光滑鱉甲絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白及制備與應用

有效

• 申請號: 201811103462.0
• 申請日: 2018-09-20
• 公開（公告）號: CN109251936B
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 劉忠淵;李再新;張蕊;毛新芳;趙鈺;楊曉霞;彭悅;楊文娟;劉陽;周倩;楊建華
• 申請（專利權）人: 四川理工學院;劉忠淵
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C12P21/02;C07K14/81;C07K1/30;A01P7/04
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1.一種光滑鱉甲絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72D，其特征在于，所述的光滑鱉甲絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72D的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一種重組表達載體，其特征在于，包含權利要求1所述的光滑鱉甲絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72D的核苷酸序列。

3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，該重組表達載體的載體骨架為pET-32a原核表達載體。

4.一種重組表達轉化體，其特征在于，包含編碼如權利要求1所述的光滑鱉甲絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72D的核苷酸序列或權利要求2～3任一項所述的重組表達載體。

5.根據權利要求4所述的重組表達轉化體，其特征在于，其為大腸桿菌BL21(DE3)。

6.一種融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72D的制備方法，培養誘導權利要求4所述的重組表達轉化體，獲得融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72D，其特征在于，所述的融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72D具體制備方法如下：

（1）菌種活化：將高溫滅菌后的牙簽用鑷子取出從保存重組大腸桿菌表達轉化體pET-32a-Ap Serpin-FA72D的甘油管中蘸取菌液，在固體培養基中進行劃線，然后將其置于37℃的恒溫培養箱中培養10~14h，挑取菌體于1.5m L含有液體LB培養基的EP管中，37℃ 220rpm培養4~6h；

（2）搖瓶種子培養：將步驟（1）獲得的菌株，接入1 L搖瓶種子LB培養基中，于37℃ 220rpm培養12h，菌液OD值為1.1～1.6，p H為7.1～7.6，培養結束；

（3）發酵罐培養：將10%的步驟（2）獲得的種子發酵液，接種于TB培養基的生物發酵罐中，重組大腸桿菌表達轉化體最佳發酵條件為溫度37℃，轉速500 rpm，通氣量為6L／min時，pH值為7.0；取1 m L發酵產物進行稀釋，當測得的OD值在0.2～0.8之間為合格；

（4）融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72D的純化：對步驟（3）獲得的大量表達轉化體進行離心超聲破碎，將所得上清進行硫酸銨沉淀法提取可溶性Trx A-Ap Serpin-FA72D蛋白，對所得沉淀進行包涵體蛋白的提取的獲得包涵體Trx A-Ap Serpin-FA72D蛋白。

7.如權利要求1所述融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72D在抑制棉鈴蟲、茶尺蠖和菜青蟲鱗翅目害蟲中的應用。