[發明專利]豬傳染性胃腸炎病毒熒光定量RT-PCR檢測的引物、探針及方法

在審

• 申請號: 201811095869.3
• 申請日: 2018-09-19
• 公開（公告）號: CN109762931A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 李守軍;白偉杰;郭慧娟;張桂紅;呂茂杰;郁宏偉;張英
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 陳松

本發明涉及豬傳染性胃腸炎病毒熒光定量RT?PCR檢測的引物、探針及方法。根據豬傳染性胃腸炎病毒N基因保守序列，設計合成特異性引物和TaqMan探針，通過優化反應條件，建立了TGEV TaqMan熒光定量RT?PCR方法。標準曲線具有良好的線性關系；敏感性好，最低可準確檢測到102copies/μl；特異性高，除TGEV外的常見豬源病毒均未出現擴增曲線；重復性好，批內和批間重復變異系數均小于2％。本發明的優點在于較高的特異性、敏感性和重復性，可以應用于大規模、高通量的樣本檢測。

技術領域

]本發明屬于動物病毒學和分子生物學技術領域，具體涉及豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法。

背景技術

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的高度接觸性傳染病，以引起一周齡以下仔豬嘔吐、水樣腹瀉和高死亡率為主要特征，對我國養豬業造成了巨大的經濟損失。TGEV感染的早期診斷對該病的防控，減少經濟損失具有重要意義，因此需要建立一種敏感快速的檢測方法。目前已經建立了一些檢測TGEV的熒光定量PCR方法，但均一些不足之處。如中國文獻專利號CN102154516A公開了一種根據豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)S基因保守序列，設計、優化出一對特異的PCR引物，建立了一種快速定量檢測TGEV的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR方法。該方法檢測靈敏度比普通RT-PCR高100倍，并且避免了常規PCR檢測帶來的高污染率。但是，該專利方法假陽性率較高，敏感性較低，準確性較差。

發明內容

本發明的目的在于提供一種豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，旨在解決現有檢測方法靈敏度差，陽性檢出率低，重復性不好，不能很好地用于豬傳染性胃腸炎病毒臨床樣品的診斷以及流行病學調查的問題。

熒光定量PCR標準品要求包含高度保守、特異的序列，以保證反應的高度特異性。TGEV編碼四種結構蛋白，分別為纖突蛋白(S)、小膜蛋白(sM)、膜內蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)，其中N蛋白高度保守，序列分析不同毒株間同源性在95％以上。N蛋白不僅是病毒的主要結構蛋白，而且在病毒RNA的復制加工過程中具有重要作用。因此，可以利用N蛋白來建立針對TGEV的分子生物學診斷技術。而TaqMan探針法對目標序列有很高的特異性，設計相對簡單，假陽性低且重復性好。

本發明的目的在于提供一種豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，旨在解決現有檢測方法靈敏度差，陽性檢出率低，重復性不好，不能很好地用于豬傳染性胃腸炎病毒臨床樣品的診斷以及流行病學調查的問題。

本發明的技術方案如下：

本發明涉及的豬傳染性胃腸炎病毒N基因TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，包括步驟如下：

(1)設計、合成引物：根據TGEV N基因保守序列(SEQ ID No.1)，設計一對特異性引物和探針；

(2)制備重組質粒標準品：PCR擴增N基因目的片段，連接pMD18-T載體，挑取陽性克隆測序鑒定，序列為SEQ ID No.2；

(3)優化TaqMan熒光定量RT-PCR反應條件：

擴增時使用的引物、探針分別為：

正向引物：5'-GCTTGGTAGTCGTGGTGCT-3'(SEQ ID No.3)；

反向引物：5'-TGGATTGTTGCCTGCCTC-3'(SEQ ID No.4)；

探針：5'-FAM-AAATTCGATGGTAAAGTGCCAGGCG-TAMRA-3'(SEQ ID No.5)；