[發(fā)明專利]NDRV弱毒株的選育方法及其在制備NDRV活疫苗中的應用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811093038.2 | 申請日： | 2018-09-19 |
| 公開（公告）號： | CN109295007B | 公開（公告）日： | 2022-03-15 |
| 發(fā)明（設計）人： | 陳少鶯;程曉霞;陳仕龍;林鋒強;俞伏松;王劭;肖世峰;朱小麗;鄭敏;黃梅清 | 申請（專利權(quán)）人： | 福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 |
| 主分類號： | C12N7/00 | 分類號： | C12N7/00;A61K39/15;A61P31/14;C12R1/93 |
| 代理公司： | 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245 | 代理人： | 關暢;陳曉慶 |
| 地址： | 350003 福建省*** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | ndrv 弱毒株 選育 方法 及其 制備 疫苗 中的 應用 | ||
本發(fā)明公開了一種NDRV弱毒株的選育方法及其在制備NDRV活疫苗中的應用。本發(fā)明首次將新型鴨呼腸孤病毒株NDRV?JM85接種SPF鴨胚成纖維細胞(DEF)在5.0％CO2、32℃和37℃條件下連續(xù)交替?zhèn)鞔?70代后，選育獲得一株遺傳性狀穩(wěn)定、安全性好、免疫原性強的NDRV弱毒株，將其命名為NDRV S株，NDRV S株的保藏編號為CCTCC NO：V201850。并應用NDRV S株接種鴨胚成纖維細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，收獲細胞毒加凍干保護劑，冷凍真空干燥，研制成NDRV活疫苗。通過實驗證明：本發(fā)明的NDRV活疫苗安全，且具有較好的免疫效果和遺傳穩(wěn)定性，可有效預防新型鴨呼腸孤病毒病。
技術領域
本發(fā)明涉及新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)弱毒疫苗株的選育方法及其在研制活疫 苗中的應用，屬于獸用生物制品學領域。
背景技術
2005年以來，在中國福建、廣東、江蘇、山東和漸江等省(地)的番鴨、半番鴨、 櫻桃谷鴨和麻鴨群發(fā)生一種以肝臟不規(guī)則壞死和出血混雜為主要特征的疫病(俗稱“鴨 出血壞死性肝炎”)，該病無明顯季節(jié)性，各品種鴨(如番鴨、半番鴨、麻鴨、北京 鴨等)均可發(fā)生，并有逐年增加的趨勢；發(fā)病日齡約為3～25日齡，其中以5～l0日 齡居多，病程為5～7天，發(fā)病率為5～20％，死亡率為2～15％，日齡愈小或并發(fā)感 染時其發(fā)病率和死亡率愈高；由于病原不明，給養(yǎng)鴨業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。
為有效防控該病，福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物病毒研究室開展了病原、 診斷和防控技術研究，對分離毒株進行了全面系統(tǒng)鑒定，從病毒理化生物學、動物回歸試驗、基因組特性及分子水平上首次證實鴨出血壞死性肝炎的病原是一種有別于番 鴨呼腸孤病毒(MDRV)和禽呼腸孤病毒(ARV)的一種新型鴨呼腸孤病毒(Novel DuckReovirus，NDRV)(陳少鶯等，病毒學報，2010)，并建立了能快速準確診斷該病的 RT-PCR方法(王劭等)。在此基礎上開展弱毒株選育及其應用研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人工致弱新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)獲得弱毒疫苗株 的方法及其在研制NDRV活疫苗中的應用。
第一方面，本發(fā)明保護一種新型鴨呼腸孤病毒弱毒株的選育方法。
本發(fā)明提供的新型鴨呼腸孤病毒弱毒株的選育方法包括將新型鴨呼腸孤病毒在溫 度甲的條件下和溫度乙的條件下連續(xù)交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)的步驟；
所述溫度甲可為37.0-37.5℃；所述溫度乙可為32.0-32.5℃。
上述方法中，所述連續(xù)交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)的方法如下：
1)將所述新型鴨呼腸孤病毒株接種至細胞中，在所述溫度甲的條件下進行傳代培養(yǎng)，當細胞病變達到75-80％時，凍融，收集細胞毒株，并將其記作毒株1；
2)將所述毒株1接種至細胞中，在所述溫度乙的條件下進行傳代培養(yǎng)，當細胞病變達到75-80％時，收集細胞毒株，凍融，并將其記作毒株2；
3)將所述毒株2接種至細胞中，在所述溫度甲的條件下進行傳代培養(yǎng)，當細胞病變達到75-80％時，收集細胞毒株，凍融，并將其記作毒株3；
4)將所述毒株3接種至細胞中，在所述溫度乙的條件下進行傳代培養(yǎng)，當細胞病變達到75-80％時，凍融，收集細胞毒株，并將其記作毒株4；
5)按照上述方法連續(xù)交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)，直至得到遺傳性狀穩(wěn)定、安全性好且免疫原性強的新型鴨呼腸孤病毒株，即為所述新型鴨呼腸孤病毒弱毒株。
上述方法中，所述溫度甲具體可為37℃；所述溫度乙具體可為32℃。
上述方法中，病毒株的遺傳性狀穩(wěn)定性、安全性和免疫原性均可通過現(xiàn)有技術中的常規(guī)方法進行測定。
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