[發(fā)明專利]一種檢測蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的電化學(xué)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811085125.3
• 申請日: 2018-09-18
• 公開（公告）號: CN109187708B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 苗向陽;吳昀;王楊;郁惠珍;顧準(zhǔn)
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/00
• 分類號: C12Q1/00
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32267
• 代理人: 馬廣旭

本發(fā)明公開了一種檢測蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的電化學(xué)方法，P1修飾的金電極和p300蛋白的檢測體系中加入P2模板化銀納米粒子和葫蘆[8]脲，通過電化學(xué)測量檢測p300蛋白的活性，從而得到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移化酶活性；所述P1的氨基酸序列為：11?巰基十一烷酸(MUA)?GGGFRGKGGKGLGKGGAKA；所述P2的氨基酸序列為：FGGGASLWWSEKL。以p300為模型，以信號模板P2合成銀納米粒子，通過腔體與傳感模板P1進(jìn)行組裝，既保證了檢測的靈敏性，又具有高度的設(shè)計靈活性，同時增強了HATs的選擇性。發(fā)展能夠檢測HATs活性的簡單、實用的電化學(xué)方法，有望為重大疾病的早期診斷提供幫助。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物電化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的電化學(xué)方法。

背景技術(shù)

1931年，Warburg醫(yī)生憑借“癌癥是代謝性疾病”的重大發(fā)現(xiàn)，獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。美國多所大學(xué)的研究也證實：基因不是癌癥產(chǎn)生的根本因素，掌控癌癥產(chǎn)生的是細(xì)胞質(zhì)。正常細(xì)胞質(zhì)和癌細(xì)胞質(zhì)的區(qū)別，就是代謝的不同，因此，代謝障礙才是細(xì)胞癌變的根源。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)估計，2015年全世界約有1/4 的人口患有代謝綜合征（metabolicsyndrome，MS），我國的患病率為16.5%，年齡標(biāo)化后男女患病率分別為10.0%和23.3%，北方患病率高于南方，城市患病率高于農(nóng)村。研究發(fā)現(xiàn)，83%的糖尿病患者和51%心腦血管疾病是由于MS引起，而大多數(shù)高血壓的發(fā)生也由MS引起。我國現(xiàn)有7700萬MS患者，即每8個成年人中至少有1人患有MS，這超過了目前其他任何一種疾病的患病率。通過廣州市體檢人群的研究表明，普通人群的MS患病率以平均每年0.97%的速度遞增。2014年在重慶市35歲及以上人群中調(diào)查得出MS標(biāo)化患病率為18.72%，女性（25.55%）顯著高于男性（12.90%）。MS以肥胖、血壓升高、血糖升高以及血脂異常為主要臨床表現(xiàn)，多種危險因子匯聚于同一個個體，是嚴(yán)重影響人類健康的代謝性疾病。但是，MS的早期癥狀并不明顯，臨床上主要通過測試患者的身高、體重、血壓，以及血糖、血脂的指標(biāo)進(jìn)行綜合評估。這種評估缺乏直接的證據(jù)，確診率較低，失去了最佳的治療時機。在此背景下，發(fā)展有效的MS早期檢測技術(shù)成為MS治療領(lǐng)域急需解決的問題之一。

早期檢測蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)活性的方法主要依賴于放射自顯影法及放射性同位素標(biāo)記，該傳統(tǒng)檢測方法存在放射性標(biāo)記耗時費力、成本高及對環(huán)境污染較大等缺點。多種HATs自身作用于底物并無法完成反應(yīng)，還需要共反應(yīng)物乙酰輔酶 A 提供乙酰基才能進(jìn)行乙酰化反應(yīng)， 在這過程中會產(chǎn)生輔酶 A， 建立一種方法定量其副產(chǎn)物，也同樣能夠間接地檢測HATs的活性，但是對酶的間接檢測是其無法克服的缺陷。另外，還易受到反應(yīng)液中其他還原性物質(zhì)或者其它巰基小分子的干擾，從而導(dǎo)致靈敏度的提高受到限制。

通過酶聯(lián)免疫（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的方法對HATs進(jìn)行的檢測已經(jīng)進(jìn)入了商品化。依賴酶聯(lián)免疫吸附的原理是將組蛋白H3和H4的氨基末端尾部與抗原決定簇標(biāo)記的麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)連接產(chǎn)生融合蛋白。該融合蛋白發(fā)生反應(yīng)后，經(jīng)凝膠電泳分離后，通過顯色來檢測酶反應(yīng)活性。在乙酰化抗體識別的方法上，2011年MollyM.Stevens 教授設(shè)計了一種依賴于乙酰化特異性抗體底物多肽調(diào)控與量子點間的熒光能量共振轉(zhuǎn)移進(jìn)行HATs檢測的傳感器。同樣的還有基于乙酰化抗體介導(dǎo)的金納米顆粒（AuNPs）組裝策略。2013年 Jiang Jianhui 課題組基于上述思路報道了比色的方法用于HATs檢測。基于酶聯(lián)免疫和乙酰化抗體識別的方法是乙酰化相關(guān)酶活性檢測的主導(dǎo)工具，但是存在著如抗體批次之間的差異、抗體標(biāo)記的高成本和復(fù)雜探針的制備等缺點。

Minoru Yoshida 課題組自 2009 年以來，發(fā)表了一系列文章報道了基于溴結(jié)構(gòu)域特異性識別乙酰化的方法用于乙酰化相關(guān)酶的檢測，對多種細(xì)胞內(nèi)的乙酰化水平實現(xiàn)實時連續(xù)地監(jiān)測。