[發明專利]一種利用CRISPR/Cas9制備重組豬偽狂犬病毒的方法

在審

• 申請號: 201811083026.1
• 申請日: 2018-09-17
• 公開（公告）號: CN109321571A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 徐高原;孫芳;周明光;張華偉;郝根喜
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/65;C12N7/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

本發明屬于基因工程技術領域，具體公開了一種利用CRISPR/Cas9制備重組豬偽狂犬病毒的方法。本發明利用基因編輯技術CRISPR/Cas9，向PRV的gE編碼區引入熒光蛋白的編碼序列，成功篩選到陽性重組病毒后再用同樣的技術將熒光蛋白基因替換為一段無關序列(長500bp的LysC序列)，形成插入突變，使PRV的gE蛋白表達缺失。本發明利用熒光蛋白從無到有、再從有到無的可視化篩選，簡化了篩選程序，提高了重組病毒構建的效率，縮短了實驗周期。并通過在豬偽狂犬病毒(PRV)的gE編碼區引入插入突變，使制備的重組病毒可用作PRV減毒疫苗的研發，同時該無關序列可以用作免疫毒和野生毒的鑒別診斷。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體地說，涉及一種利用CRISPR/Cas9制備重組豬偽狂犬病毒的方法。

背景技術

公開號為CN106929485A的中國專利申請，公開了偽狂犬病毒基因工程gB重組弱毒疫苗株及應用。該技術方案中所用到的噬斑篩選技術為盲目篩選，篩選到重組病毒為純粹概率事件，篩選后經過病毒擴增培養提取基因組進行PCR檢測，工作量較大。

公開號為CN104894075A的中國專利申請，公開了CRISPR/Cas9和Cre/lox系統編輯偽狂犬病毒基因組制備疫苗方法和應用。該技術方案利用兩種基因編輯技術，前期構建克隆工作繁瑣且工作量大。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，克服現有技術中重組病毒篩選和純化的過程盲目、繁瑣、工作量大的缺點，以及使用兩套基因編輯技術，思路和操作都較為復雜，工作量較大的缺點，本發明的目的是提供一種僅使用CRISPR/Cas9基因編輯技術，通過先后在PRV的gE編碼區插入熒光標記序列和無關序列，以實現操作簡便、提高篩選效率的目的。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

本發明提供一種利用CRISPR/Cas9制備重組豬偽狂犬病毒的方法。所述方法用于快速構建一個重組豬偽狂犬病毒，使其結構蛋白gE表達缺失。

所述構建思路如圖1所示，所述方法包括如下步驟：

(1)利用CRISPR/Cas9系統使豬偽狂犬病毒基因組gE編碼區的特定位置斷裂。

(2)利用細胞內同源重組的基因修復系統，向細胞提供帶熒光標記序列的同源重組模板，在斷裂位置插入熒光標記序列；

所述熒光標記可以是本領域常用的熒光標記，例如綠色熒光蛋白EGFP、紅色熒光蛋白mCherry、黃色熒光蛋白YFP等，本發明以EGFP為例作為示例性說明。

本發明通過加入了熒光標記序列，使得重組成功的病毒會表達EGFP綠色熒光蛋白，在噬斑篩選時只需要挑選有綠色熒光的噬斑直接接種到細胞中進行下一輪純化即可，該可視化篩選方案大大提高的重組病毒的篩選效率并減少了重組病毒純化的工作量。

(3)利用噬斑篩選技術，篩選有熒光的噬斑接種到細胞中進行純化篩選得到熒光序列成功重組的病毒，命名為PRV-EGFP/gE-。

(4)利用CRISPR/Cas9系統使豬偽狂犬重組病毒PRV-EGFP/gE-基因組在步驟(1)相同的位置再次斷裂(與第一次斷裂使用同樣的sgRNA)。

(5)利用細胞內同源重組的基因修復系統，向細胞提供帶無關序列的同源重組模板，在斷裂位置插入無關序列。

(6)篩選無熒光的病毒，所得病毒即為gE蛋白表達缺失的重組病毒。

本發明僅利用CRISPR/Cas9單個基因編輯系統，即可完成偽狂犬病毒基因組的重組。重組病毒篩選和純化過程均為可視化操作，操作簡單，工作量小，適合條件有限的實驗室采用。本發明通過采用插入突變而不是直接缺失編碼區，可以通過PCR鑒定插入序列，而不用檢測gE蛋白的表達，為鑒別診斷提供更簡便的方法。