[發明專利]L-乳酸生產的耐熱酵母工程菌株的構建及應用

有效

• 申請號: 201811079846.3
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109266565B
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 洪泂;孔昕;王冬梅
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C07K14/395;C12P7/56;C12R1/645
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

1.一種L-乳酸生產酵母工程菌株，所述酵母工程菌株為重組表達瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)L-乳酸脫氫酶基因PfLDH的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)工程菌株，其中所述酵母工程菌株的D-乳酸脫氫酶基因KmDLD1被敲除，所述酵母工程菌株進一步重組表達下述基因二者：馬克斯克魯維酵母果糖-6-磷酸激酶基因KmPFK和釀酒酵母的乳酸轉運蛋白基因ScJEN1，其中所述酵母工程菌株的丙酮酸脫羧酶基因KmPDC1和甘油-3磷酸脫氫酶基因KmGPD1被敲除，其中所述酵母工程菌株的木糖還原酶基因KmXYL1和木糖醇脫氫酶基因KmXYL2被敲除，并重組表達粗糙脈孢霉木糖還原酶基因NcXYL1和樹干畢赤酵母木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2-ARS。

2.一種L-乳酸生產酵母工程菌株，其于2018年8月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會的普通微生物中心CGMCC，保藏號為CGMCC No.16192。

3.一種構建權利要求1或2所述的L-乳酸生產酵母工程菌株的方法，所述方法包括在馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)工程菌株中重組表達瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)L-乳酸脫氫酶基因PfLDH，敲除D-乳酸脫氫酶基因KmDLD1，進一步重組表達下述基因二者：馬克斯克魯維酵母果糖-6-磷酸激酶基因KmPFK和釀酒酵母的乳酸轉運蛋白基因ScJEN1，敲除丙酮酸脫羧酶基因KmPDC1和甘油-3磷酸脫氫酶基因KmGPD1，敲除木糖還原酶基因KmXYL1和木糖醇脫氫酶基因KmXYL2，并重組表達粗糙脈孢霉木糖還原酶基因NcXYL1和樹干畢赤酵母木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2-ARS，從而獲得L-乳酸生產酵母工程菌株。

4.權利要求3所述的方法，其中以野生型馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)或工程改造的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)為出發菌株構建所述L-乳酸生產酵母工程菌株。

5.權利要求4所述的方法，其中工程改造的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)為馬克斯克魯維酵母YZB058。

6.權利要求3-5中任一項所述的方法，其中通過表達質粒重組表達所述基因。

7.權利要求6所述的方法，其中使用馬克斯克魯維酵母來源的啟動子通過表達質粒重組表達所述基因。

8.權利要求7所述的方法，其中使用馬克斯克魯維酵母來源的KmPGK啟動子、KmTEF1啟動子、KmURA3啟動子、KmADH啟動子通過表達質粒重組表達所述基因。

9.權利要求6所述的方法，其中使用釀酒酵母來源的啟動子通過表達質粒重組表達所述基因。

10.權利要求9所述的方法，其中使用釀酒酵母來源的PGK啟動子、TEF1啟動子、GAL1啟動子、TDH3啟動子、ADH啟動子通過表達質粒重組表達所述基因。

11.權利要求1或2所述的L-乳酸生產酵母工程菌株用于L-乳酸生產的用途。

12.一種生產L-乳酸的方法，所述方法包括將底物與權利要求1或2所述的L-乳酸生產酵母工程菌株接觸以生產L-乳酸。

13.權利要求12所述的方法，其中所述方法還具備下述一種或多種特征：1)所述方法在高于30℃并且在47℃以下的溫度進行，2)所述底物是含木質纖維素、葡萄糖、木糖、半乳糖和菊糖中的一種或多種的底物，3)所述底物為未經處理的底物或為經處理的底物，和4)所述方法通過分批發酵或補料分批發酵進行。