[發明專利]基于單細胞水平的早期癌癥檢測方法

在審

• 申請號: 201811078927.1
• 申請日: 2018-09-17
• 公開（公告）號: CN109187474A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 徐艇
• 申請（專利權）人: 江蘇瑞明生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/50
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益;閆玉芳

本發明公開了一種基于單細胞水平的早期癌癥檢測方法，該方法將乳酸脫氫酶修飾在納米探頭尖端，選擇人乳腺癌細胞株MCF7作為試驗用細胞株，可以催化乳酸轉化并產生NADH作為熒光檢測物來監測腫瘤細胞的細胞外乳酸濃度。本發明檢測方法細胞外乳酸濃度的檢測結果精確，能夠真實反映在某個濃度下對應的單個細胞熒光信號值，從而能夠真實準確反映乳酸的胞外釋放。本發明檢測方法能夠從單細胞水平區分正常細胞與癌細胞的代謝，這對于理解癌變的分子機理和早期癌癥的診斷以及預后具有重要的意義。

技術領域

本發明涉及一種基于單細胞水平的早期癌癥檢測方法，屬于生物細胞檢測領域。

背景技術

癌變過程中腫瘤細胞具有獨特的代謝表型，因此，腫瘤代謝研究對腫瘤學大量的應用很有前景，包括早期癌癥診斷，疾病預后，治療效果評估和治療進展。單細胞水平的代謝研究是非常有用的，因為它給揭示細胞異質性和解讀復雜代謝的相互作用提供了機會，從而進一步解密各種代謝途徑。因此，生物傳感平臺能夠從單細胞水平區分正常細胞與癌細胞的代謝，這對于理解癌變的分子機理和早期癌癥的診斷以及預后尤其重要。

《分析化學》2010年82卷5082-5087頁論文(Anal.Chem.2010,82,5082–5087)“腫瘤代謝分析中單細胞乳酸釋放的光學檢測”中提出的一種基于單細胞水平的早期癌癥檢測方法，但該方法的靈敏度不夠高，重復性較差，因此本發明進一步優化出靈敏度更高，重復性更好的試驗參數。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種更有效、更加優化的基于單細胞水平的早期癌癥檢測方法，該方法將乳酸脫氫酶修飾在納米探頭尖端，可以催化乳酸轉化并產生NADH作為熒光檢測物來監測腫瘤細胞的細胞外乳酸濃度。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下:

一種基于單細胞水平的早期癌癥檢測方法，包括如下步驟：

步驟1，納米探頭尖端二氧化硅表面在APTES乙醇溶液中進行硅烷化，干燥后在戊二醛溶液中進行活化，然后在乳酸脫氫酶溶液中培養進行固定化。

步驟2，選擇人乳腺癌細胞株MCF7作為試驗用細胞株，并對試驗用細胞株進行消化吹打處理形成細胞懸液。

步驟3，用血球計數板測定細胞懸液中的細胞密度，以細胞密度為1×10⁴個細胞/cm²接種到細胞浴槽的蓋玻片上用于細胞附著。

步驟4，細胞組依次附著24h、25h、26h、27h后，用PBS緩沖液沖洗粘附在蓋玻片上的細胞3次，向細胞浴槽中分別加入100μl、110ul、120ul、130ul的細胞培養液，細胞培養液中添加NAD+溶液。

步驟5，將細胞浴槽放入納米光電生化檢測儀，在倒置熒光生物顯微鏡下調整納米探頭靠近細胞膜，檢測并記錄反應過程中釋放的NADH熒光光子數。

其中，步驟1中，所述APTES乙醇溶液濃度為5％。

其中，步驟1中，所述戊二醛溶液濃度為5％。

其中，步驟1中，所述乳酸脫氫酶溶液濃度分別為2mg/ml，1.8mg/ml,1.6mg/ml,1.5mg/ml。

其中，步驟2中，先將試驗用細胞株用PBS緩沖液清洗，清洗后用0.25％的胰蛋白酶溶液消化細胞，細胞消化后用含血清的培養基終止消化，將混懸液吸到離心管中，1000r/min離心5min，得到的沉淀物用含血清的培養基重懸吹勻即可。

其中，步驟3中，所述細胞浴槽的蓋玻片為細胞可爬壁生長的蓋玻片。

其中，步驟4中，所述添加NAD+溶液的終濃度為2mM、1.8mM、1.6mM、1.5mM。

其中，步驟5中，所述納米探頭通過微操作系統進行控制移動。