[發明專利]一種抗體純化方法

在審

• 申請號: 201811076663.6
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109134648A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 冷毅斌;王長樂
• 申請（專利權）人: 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 廉海濤

本發明實施例提供了一種抗體純化方法，用M1重組蛋白免疫的動物，對重組蛋白質反應度優于天然蛋白質，能夠產生性能穩定、抗原效價高的單抗，采用CA?AS法進行抗體純化，抗體回收率、抗體活性、抗體純度等方面存在較大優勢，且此法操作簡便，可重復使用，生產成本較低。

技術領域

本發明實施例涉及生物制藥技術領域，更具體地，涉及一種抗體純化方法。

背景技術

當代抗體藥物的工藝研發是基于基因工程、細胞工程和發酵工程基礎之上的，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞作為主要的哺乳動物細胞表達宿主細胞具有遺傳背景清晰、具備翻譯后加工能力等特點，成為了蛋白質生產的標準工業化細胞株，同樣也適合于抗體蛋白的表達。隨著細胞懸浮培養技術的發展，使得大規模培養成為可能，而無血清培養基的應用則使得蛋白純化工藝更為簡便，這一切都大大加速了抗體藥物的產業化進程，為制備價廉質優的抗體藥物奠定了基礎。

自首個單克隆抗體制備以來，在Koehler和Milstein的基礎上經過近30年的蓬勃發展，單克隆抗體制備技術在生命科學研究以及醫學實踐方面做出了巨大的貢獻，已成為了現代生物技術支柱產業之一。單克隆抗體藥物因其靶向特異性，毒副作用低，治療的高效性等明顯優勢在腫瘤自身免疫疾病、器官移植排斥及病毒感染等領域有重要的應用。抗體藥物制造工藝從研發時期的細胞株構建、培養基優化、上游細胞培養、下游純化到最后制劑這五個方面的任何一個環節都對抗體藥物有很重要的影響，其中又以下游純化工藝最為復雜繁瑣，下游工藝含有多個步驟，目前常用的的是親和層析、離子層析和疏水層析串聯使用的方法。雖然目前都采用這種模式，但是每個工藝中細小參數的變化都有可能導致巨大的變異。下游層析工藝中除了要除去HCP、殘留DNA和二聚體多聚體等雜質之外還要對上游可能引入的病毒進行去除。

抗體藥物生產過程中，親和層析通常用于抗體的捕獲階段，即第一個純化工藝步驟，從發酵料液中選擇性分離出所需抗體，接著用離子交換層析和/或疏水層析和/或混合模式層析，來進一步精純親和層析洗脫下來的抗體。就一般工藝而言，親和層析洗脫得到的樣品通常會進行低pH病毒孵育，并且進行下一步層析前都會對低pH孵育的樣品進行處理，以達到不同層析方法需要的操作條件。

傳統的陰離子層析前樣品的處理，一般都是一步調pH，即直接將低pH孵育的樣品回調到陰離子層析上樣所需的pH范圍。但是該方法可能會導致抗體不穩定，生成沉淀從而造成樣品的損失，另外對抗體的雜質去除效果不理想，增加陰離子層析吸附雜質的量，對層析填料造成傷害，縮短其壽命。陰離子交換層析主要是去除細菌內毒素、宿主蛋白和DNA雜質等，常規的方法是采用流穿(flow-through)方式，抗體直接通過柱子，而污染物被吸收抗體藥物中雜質的存在會導致藥效降低，嚴重的會導致人體死亡。例如：含有內毒素或被內毒素污染的藥物進入人體后會引起多種變態反應，如：高燒、休克、甚至死亡。許多抗體，包括IgG和IgM，均會形成聚集物，聚集物的存在會產生和主產品不同的藥效，會造成抗藥性抗體的形成。殘留的宿主細胞蛋白有可能刺激機體發生免疫應答產生相應的抗體，同樣會對人體造成傷害。

發明內容

本發明實施例提供了一種克服上述問題或者至少部分地解決上述問題的一種抗體純化方法。

本發明實施例提供了一種抗體純化方法，包括：

步驟一、在M1基因SEQ NO.2中插入表達載體pet32a，得到M1重組蛋白，以所述M1重組蛋白為抗原，免疫動物，再進行細胞融合和亞克隆；將上述亞克隆后的細胞擴大培養并注射至小鼠腹腔，7-10日后抽取小鼠體內的腹水，將腹水在–20℃下保存；