[發明專利]一種組織修復能力強的脂肪干細胞分離培養及篩選方法

在審

• 申請號: 201811076568.6
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109082409A
• 公開（公告）日: 2018-12-25
• 發明（設計）人: 范兆心
• 申請（專利權）人: 四川新生命干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種組織修復能力強的脂肪干細胞，其特征在于：它是具有如下特征的脂肪間充質干細胞：

a、匯合度為80％時，培養上清液中，每毫克總蛋白中血管內皮生長因子含量≥300pg；

b、表達抗原CD10，不表達抗原CD200。

2.根據權利要求1所述脂肪干細胞，其特征在于：所述細胞中，匯合度為80％時，培養上清液中，每毫克總蛋白中血管內皮生長因子含量≥500pg。

3.權利要求1或2所述的細胞的制備方法，其特征在于：取脂肪間充質干細胞，培養，檢測細胞匯合度為80％時，培養上清液中每毫克總蛋白中血管內皮生長因子含量，同時檢測細胞的抗原CD10、CD200的表達情況，選擇具有權利要求1或2所述特征的細胞。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述培養基為含有體積分數為2％-5％的富血小板血漿PRP的DMEM/F12培養基，培養條件為37℃、5％CO₂；所述富血小板血漿PRP按照如下方法制備：取血液，加入檸檬酸鈉至0.05～0.15mol/L，置于低溫離心機中以4000g離心15min，收集上層液，即為富血小板血漿；優選地，加入檸檬酸鈉至0.1mol/L。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述脂肪間充質干細胞按照如下方法制備：

(1)取脂肪組織，進行0.05-1％(w/v)的膠原酶液消化；

(2)取消化后的脂肪組織，離心，得到基質血管組分；

(3)將分離的血管基質組分，加入培養基重懸后進行培養，得到脂肪干細胞；所述培養基為含有體積分數為2％-5％的富血小板血漿PRP的DMEM/F12培養基，所述富血小板血漿PRP按照如下方法制備：取血液，加入檸檬酸鈉至0.1mol/L，置于低溫離心機中以4000g離心15min，收集上層液，即為富血小板血漿；

(4)脂肪干細胞原代培養至匯合度80％進行消化傳代培養，得到脂肪間充質干細胞。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟(1)中，所述消化是將脂肪組織與消化液按體積比1:1混合，置于37℃恒溫搖床中轉速50-250rpm消化0.5-4h。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，所述離心是150-2000g離心5min。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟(3)中，所述培養瓶為T75培養瓶；所述培養的條件為：37℃，2-8％CO₂，飽和濕度培養箱中培養，48h后第一次換液，之后每2d換液一次。

9.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟(3)中，傳代擴增比例為1:4-1:5。